全同胞荷斯坦公牛精液品质差异的DNA甲基化调控机制解析

DNA methylation pattern is characterized by relatively stable, which plays important roles on the bovine spermatogenesis and maturation process. However, molecular mechanism underlying the process is still unclear. Full-sib bulls emerge commonly during the breeding and reproduction of young bull using embryo transfer. These full-sib bulls usually exhibit significantly differential semen quality phenotype in spite of their similar genetic backgrounds, which are regarded as a good model for the research regarding epigenetics. In the project, we are going to use MeDIP-seq to compare the DNA methylation differences on the genome-wide between the full-sib pair bulls and various times of semen collection of each bull and subsequently to identify their differential methylated regions; we also plan to use BSP, Real-time PCR and Western-blot methods to confirm the differentially methylated regions, genes and their expressions and to clarify the relationships between methylation region and semen quality traits; we would excavate the epigenetic markers associated with semen quality basing on the genome-wide DNA methylation dataset. The findings would provide insights into the molecular mechanism of spermatogenesis and maturation. They would also develop a novel ideal and approach for the molecular breeding in high-fertility Holstein bull.

DNA甲基化模式的变化相对比较稳定，它在精子发生和成熟过程中发挥重要调控作用。种公牛精子发生与成熟的分子机制尚不清楚。通过胚胎移植培育后备公牛时常发现全同胞公牛荷斯坦公牛虽然具有相似遗传背景，精液品质却存在显著差异，这为研究表观遗传学对精子发生与成熟的作用提供了良好的动物模型。本研究利用全基因组甲基化测序技术（MeDIP-seq）检测高、低繁殖力全同胞配对公牛之间和不同采精年龄的精子基因组DNA甲基化水平的差异，筛选有效的差异甲基化区域，分析甲基化变异的程度；通过亚硫酸氢盐处理后测序、荧光实时定量PCR和Western blot技术验证公牛精子基因组差异甲基化区域的甲基化水平与基因表达的和精液品质性状的关系；在基因组范围内挖掘出与公牛精液品质相关的基因和甲基化表观遗传标记，为阐明DNA甲基化在精子生成和成熟过程中发挥作用的机制提供证据，也可为高繁殖力公牛的分子育种开辟新的思路和途径。

DNA甲基化模式的变化相对比较稳定，它在精子发生和成熟过程中发挥重要调控作用。种公牛精子发生与成熟的分子机制尚不清楚。通过胚胎移植培育后备公牛时常发现全同胞公牛荷斯坦公牛虽然具有相似遗传背景，精液品质却存在显著差异，这为研究表观遗传学对精子发生与成熟的作用提供了良好的动物模型。本研究利用简化基因组甲基化测序（RRBS）和转录组测序（RNA-seq），从全基因组水平比较了高、低精液品质全同胞公牛精子DNA甲基化差异和基因表达差异，获得了精子基因组DNA甲基化图谱和基因表达图谱。通过RRBS测序分析，获得了位于基因区域和miRNA启动子区域的差异甲基化区域（DMRs）分别为5019个（p<0.05）和441个（p<0.05），高精液品质组与低精液品质组相比，基因启动子区域DMRs多数发生甲基化水平降低，内含子区域DMRs多数发生甲基化水平的升高，miRNA启动子区的DMRs主要位于中间启动子区域；比对分析发现110个差异甲基化基因（DMGs）位于公牛精子活力（Sperm Motility）相关的QTL区域内。通过RNA-seq分析，获得显著差异表达基因563个，GO和KEGG分析富集到了与精子发生、钙离子运输等功能相关的差异表达基因和参与鞘脂类代谢的通路。甲基化和转录组联合分析，获得均具有差异甲基化和差异表达的基因共112个；其中启动子区差异甲基化与差异表达呈负相关的基因共16个；差异甲基化miRNA与差异表达基因靶向联合分析，获得37个差异甲基化miRNAs靶向533个差异表达基因。关键基因验证：BSP和qRT-PCR分析发现候选基因CatSper2（精子阳离子通道蛋白）启动子区-171bp ~ +42bp存在DMRs，其中CpG1和CpG13差异显著（p<0.05），CatSper2在高精液品质的全同胞公牛精子中的表达显著高于低精液品质组（p<0.05）。因此，全同胞公牛虽有相似的遗传背景却表现出不同的精液品质表型，表观遗传学调控机制在其中发挥着重要的生物学作用。后续将进一步探究候选基因的DMRs对基因表达的调控及其与公牛精液品质的关系。