施氏假单胞菌氮代谢基因簇glnD-map调节固氮基因表达的分子机理

固氮基因的表达除受本身的操纵子nifLA调节外，还受到氮代谢系统ntr及gln系统的调控。GlnD被认为是感受细胞内氮-碳信号水平的初级感受器，但在不同微生物中，其感应信号的分子模式及机制存在很大差异。通过基因组及转录组分析，我们发现在固氮施氏假单胞菌中glnD与一个编码甲硫氨酰氨肽酶的map基因紧密连锁且共同转录，组成一个共转录单元，暗示着两者在功能上的相关性，但map基因在微生物氮代谢中的作用尚无报道。为了揭示A1501菌中氮信号感应蛋白GlnD的作用机制并探索map基因在固氮调控中的功能，本研究通过构建glnD、map突变株，测定其在生物固氮及氮代谢过程中的生物学功能，利用qPCR技术研究GlnD及Map对氮代谢调控关键节点蛋白表达的影响，分析碳氮偶联调控中glnD-map的信号感应模式，并探讨其参与固氮调控的分子机制。研究成果将为固氮微生物的氮代谢调控网络的揭示奠定重要的理论基础。

生物固氮是个高度耗能的过程，在长期的进化过程中固氮菌都进化出了复杂而高效的调控系统。GlnD 被认为是感受细胞内氮-碳信号水平的初级感受器，其作用尤为重要。不同微生物中，GlnD感应信号的分子模式及机制存在很大差异。固氮施氏假单胞菌中存在一个glnD编码基因，该基因与一个编码甲硫氨酰氨肽酶的map基因紧密连锁，关于这两个基因的功能及作用机制未见报道。.本研究通过突变株构建、过量表达等研究方法明确了glnD和map基因在A1501菌碳源利用、趋化、生物固氮等生理生化过程中的功能，结果表明glnD基因是A1501进行生物固氮所必需的调控因子，map基因是A1501菌进行基础生长和代谢所必需，对菌体的趋化运动及生物固氮都存在重要影响；研究发现，GlnD蛋白在调控菌体的趋化运动、生物膜形成及根表定殖方面发挥重要的调控功能，glnD基因突变对菌体趋化的影响可能通过鞭毛合成全局调控因子FleQ发挥功能，以此为突破口探索了fleQ调控菌体运动特别是鞭毛形成的分子机制；通过Real-time RT-PCR、Western blot、启动子-lacZ活性检测等方式分析了glnD和map基因在固氮调控网络中的作用机制，结果表明，glnD基因对固氮酶结构基因的表达调控是开关级别的，而对氮代谢调控基因的调控表达的影响则表明，GlnD蛋白在氮代谢调控网络中处于glnK和ntrC的上游；研究表明，GlnD蛋白对PII蛋白GlnK的尿苷化作用是开启A1501固氮基因表达的关键步骤。.综上所述，glnD基因和map基因在固氮施氏假单胞菌A1501的物质代谢、趋化运动和生物固氮中具有重要的调控作用，glnD是A1501菌感受外界信号开启固氮基因表达的关键执行者，而map基因是菌体生存的必须因子。课题执行期间共发表期刊论文9篇，其中SCI收录2篇，中文核心期刊7篇；参与外文专著撰写独立章节2篇，申请发明专利2项。参加国际学术会议3次，在18届国际固氮大会及第14届国际非豆科学术会议做学术报告。指导博士研究生3名，硕士研究生2名。本研究为固氮微生物的氮代谢调控机制及碳氮偶联调控网络的揭示奠定重要的理论基础。