睾丸酮丛毛单胞菌S44还原硒的分子机制和单质纳米硒的形成解析

Selenium is an essential trace element in life, which plays fundamental roles on human health such as involving in anti-cancer and anti-oxidation defense systems. Selenium is also important material in electronic and light industry. Microorganisms are involved in all transforming process of selenium from one oxidation state to another, in which reduction of toxic Se oxyanions to non-toxic selenium is the key process. However, molecular mechanisms of Se oxyanions reduction have not been elucidated. In this case, we focus on molecular mechanisms of selenite/ selenate reducing to elemental selenium in Comamonas testosteroni S44. Firstly, we will clone gene of selenate reductase as well as interpret electron transfer pathway of selenate reduction using transposon mutagenesis and gene clone. Secondly, we will obtain the related genes of selenite reduction and their metabolic pathway through transcriptomics, purification of protein, transposon mutagenesis, gene clone and subcellular microscopy. Finally, we would elucidate the mechanism of formation of selenium nano-particles both in C. testosteroni S44 and Burkholderia ES3-20, using methods of purification of Se nanoparticles, gene clone and EDS Mapping. Those investigations would provide guide to study Se transformation in soils and Se uptake of plant. In addition, it is possible to synthesize Se nano-particles through imitating the bio-process in industrial-scale production for medical and industrial purpose based on understanding the way of Se nano-particles assembly.

硒是生命必需的微量元素，在人体抗癌、抗氧化等方面作用重要；硒也是重要的光电材料。微生物参与了硒各价态间的转化，其中硒酸盐和亚硒酸盐还原成无毒的单质硒是关键节点，但其还原的分子机制尚未揭示。本研究以硒还原菌睾丸酮丛毛单胞菌S44为对象，在已完成的全基因组测序基础上，首先利用转座子插入突变和基因克隆等技术，克隆硒酸盐还原酶基因，解析该还原过程的电子传递路径；其次，通过转录组学、蛋白质分离纯化、插入突变和基因克隆等，并结合亚细胞显微技术，克隆还原亚硒酸盐成为单质硒的相关基因，解析其物质和能量代谢路径；最后，S44与伯克氏菌ES3-20比较，通过纳米硒分离纯化，结合EDS Mapping和基因克隆等实验，解析单质硒纳米颗粒形成的方式和机制。通过上述研究，将为进一步研究微生物转化土壤硒和植物吸收硒提供方向性指导；同时，纳米硒形成方式的解析，将为人体补硒和未来纳米硒的工业化生物合成提供新的研究基础。

硒是生命必需的微量元素，在人体抗癌、抗氧化等方面作用重要；硒也是重要的光电材料。许多微生物还原硒酸盐和亚硒酸盐成为无毒的单质纳米硒或被同化利用，是生物地球化学循环的关键节点，但其还原的分子机制所知甚少。本课题主要以4株好氧细菌为研究材料，结合形态学、分子生物学、体外酶学等研究手段，阐释了细菌将有毒的硒酸盐Se(VI)和亚硒酸盐Se(IV)还原成无毒的Se(0)的分子机制，解析了单质纳米硒颗粒的形成与稳定机理。主要结果如下。（1）阐释了睾丸酮丛毛单胞菌S44中Se(VI)的还原借用硫酸盐的多步复杂还原路径。Se(VI)首先通过膜转运蛋白进入细胞质，然后被还原为Se(IV)，再被还原为Se(0)形成纳米硒颗粒；微量硒进入同化还原最终转化成有机硒Se(-II)。（2）发现Se(IV)的还原并形成单质纳米硒颗粒存在多样化的途径，包括谷胱甘肽还原途径（施氏假单胞菌TS44和链霉菌ES2-5），位于周质空间的新型亚硒酸盐还原酶SerT（S44），细胞内的谷胱甘肽还原酶GorA（TS44）和新型Cr(VI)还原酶CsrF（类希瓦氏菌WH16-1）途径。（3）以丛毛单胞菌S44为材料，通过蛋白质组学等分析，明确富含带电氨基酸残基的蛋白质对纳米硒颗粒的形成与稳定起主导作用，对绿色可控合成稳定的纳米硒具有指导作用。总之，这些结果揭示了细菌还原Se(VI)/Se(IV)既有同化利用的需要，也有高浓度时解毒的需要；揭示了细菌中共存的多样化的Se(IV)解毒机制，即普遍的谷胱甘肽参与和特定酶参与的解毒机制，且在不同细菌中参与Se(IV)还原的酶不同。多样化的Se(IV)还原机制对寻找标记基因研究硒的环境生物过程构成了挑战，但也预示着有更多的亚硒酸盐还原分子机制需要阐释。