曼氏无针乌贼副缠卵腺细菌共生体形成机理研究

通过荧光原位杂交技术观察不同处理下乌贼体内细菌的分布情况，确定乌贼体内细菌的来源（细菌的传递方式）。利用表达谱芯片分析不同条件下乌贼副缠卵腺基因差异表达情况，寻找曼氏无针乌贼副产卵腺中与细菌共生相关的差异基因。同时，利用RT-PCR和原位杂交技术确定差异基因在副产卵腺形成过程中的表达和分布情况。在此基础上利用免疫荧光定位技术对差异基因蛋白产物进行组织和细胞定位，分析差异表达基因在对副缠卵腺发育和功能完善中的作用。分离细菌共生体中优势菌种，运用抑制性差减杂交技术分析共生菌与野生菌株的基因表达差异，弄清细菌对共生的适应性变化。通过确定乌贼内细菌的来源，细菌共生相关基因的筛选和相关基因的组织细胞定位和细菌对共生的适应性变化，从宏观上分析细菌进入的时间、共生体的形成方式、乌贼副缠卵腺对细菌的接受方式和细菌的适应性变化及生长方式，从而初步弄清乌贼副缠卵腺中细菌共生体的形成机理。

头足类副缠卵腺细菌共生体对其生命活动和繁育具有重要的作用，但对于头足类自身对于细菌的选择和调控没有深入研究。本项目通过分析细菌进入的时间、共生体的形成方式、乌贼副缠卵腺对细菌的接受方式和细菌的适应性变化及生长方式，初步弄清乌贼副缠卵腺中细菌共生体的形成机理。首先采用组织学和电镜技术研究曼氏无针乌贼的副缠卵腺及腺体细胞，确定乌贼副缠卵腺的结构；通过连续取样切片观察乌贼的胚胎和幼体，确定乌贼副缠卵腺的原基出现和器官形成过程；根据对曼氏无针乌贼胚胎发育的研究确定乌贼出膜的时间，分别用3种方式处理乌贼幼体，初步确定细菌共生体中细菌的来源于体外。在此基础上项目组利用16sRNA技术对乌贼副缠卵腺细菌共生体的形成方式进行了分析。首先分析了成体曼氏无针乌贼副缠卵腺细菌共生体中菌群的结构，根据体外来源和进入的推测进一步比较分析了不同发育阶段副缠卵腺细菌共生体和肠道的菌群结构的变化，结果发现在初期两者种群结构相似，随着副缠卵腺的功能完善，两者种群结构发生分化，发育后期副缠卵腺菌群与成体相似，与肠道菌群结构距离较远。为了进一步分析在细菌进入过程中宿主的响应，项目组利用实验室已经构建的均一化cDNA文库的分析序列，定制了曼氏无针乌贼表达谱芯片，对比了初具形态的乌贼副缠卵腺（A1）和已经功能完善的乌贼副缠卵腺（A4）中基因的表达情况，结果表明在芯片的8890个基因位点中，有311个基因的表达发生变化，功能完善期的乌贼副缠卵腺中有191个基因表达上调，120个基因表达下调，根据基因的注释结果发现上调的基因中与免疫和细菌识别相关的受体基因的高表达，且参与基础代谢和结构稳定的基因表达量上调明显，说明在细菌进入后乌贼通过免疫调节和结构完善进行响应。探索性分析了细菌共生体在繁殖中的作用，比较了细菌共生体和卵膜中的共生细菌的菌群结构，从而获得与细菌共生体的来源、形成方式和作用相关的菌群信息。同时，运用宏基因组分析在繁殖中副缠卵腺的菌群的变化和菌群基因表达的差异，发现菌群中高表达的基因主要参与细胞组成，为次生代谢提供物质基础，为进一步的乌贼副缠卵腺细菌共生体的作用研究奠定了基础。