平胸龟线粒体DNA的重复控制区进化和转录组学研究

Mitochondrial genome has been one of the hot spots of biological evolution, genetics and medical sciences research, significantly in both theory and practice. Previous studies have shown that the mitochondrial genome of Platysternon megacephalum has duplicated control regions and unique gene order. In this project, three subspecies of this turtle through its distribution range will be collected, and the sequences of the duplicated control regions and their flanking genes will be obtained using Long-PCR, nest-PCR and cloning sequencing techniques. Combined with phylogenetic analysis and RDP recombination testing methods, the evolution pattern of duplicated control regions will be explored at a micro-evolutionary level, and some proof of whether recombination occurred in the duplicated control regions and their flanking genes of mtDNA inter or intra subspecies will be documented. The complete mitochondrion organelle is obtained by discontinuous density gradient centrifugation. RNAseq directional deep sequencing, parallel analysis of RNA ends sequencing will then be performed to get the transcripts of mitochondrial genomes in P.megacephalum and Trachemys scriptare with only one control region. In order to clarify transcription regulation function of the duplicated control regions, the abundance and characteristics of transcript of mtDNA will be compared. This study may provide information of the evolution pattern, potential recombination and transcription products of mtDNA with duplicated control regions, which contributes to the mitochondrial evolutionary and molecular genetic research of animals.

线粒体基因组的研究一直是生物进化、遗传学、医学等生命科学领域的热点之一，有重要的理论和实践意义。前期的研究显示，平胸龟的线粒体基因组具有重复的控制区和独特的基因排列,本研究从微进化的角度，拟以其三个亚种为实验材料，采用Long-PCR、巢式PCR及克隆测序等技术，获得平胸龟重复控制区及其侧翼的序列，结合系统学分析和RDP重组测试方法，探讨重复控制区的进化模式并进行mtDNA在亚种内及亚种间的重组检测；采用不连续密度梯度离心获得完整线粒体，结合RNAseq深度测序和转录组分析技术，获得三个亚种及红耳彩龟（单mtDNA控制区）的线粒体转录组数据，比较分析转录产物的丰度和特征，探讨重复控制区在线粒体基因转录中的调控功能和适应性机制。本研究有望对mtDNA重复控制区的进化与重组提供新的资料，获得新的mtDNA转录本及转录后的加工产物，为动物线粒体进化和分子遗传学研究做出贡献。

线粒体基因组的研究一直是生物进化、遗传学、医学等生命科学领域的热点之一，有重要的理论和实践意义。本研究从微进化的角度，以平胸龟三个亚种为实验材料，采用Long-PCR等技术，获得了平胸龟重复控制区及其侧翼的序列，探讨了重复控制区的进化模式；采用第二代、第三代单分子测序技术，深度测序了线粒体转录组，获得中国平胸龟亚种（双控制区）及乌龟（单控制区）的线粒体转录组，比较分析了转录产物的丰度和特征，探讨了重复控制区在线粒体基因转录中的调控功能和适应性机制。.平胸龟重复控制区及其侧翼序列的分析及聚类结果显示，平胸龟三个亚种不同个体的直系同源拷贝（CRI或CRII）在一起，而来自同一个体的并系同源拷贝(CRI和CRII却没有聚在一起。此结果表明，平胸龟双控制区可能是独立进化，而不是协同进化。同时，所构建的系统发生树中，T2的CRI与B支聚类，而CRII与C支发生聚类。证明了T2个体是缅甸亚种与越南亚种的杂交后代。基于此，我们推测平胸龟mt DNA双控制区可能起源于异源重组。高通量测序平胸龟和乌龟的线粒体mtDNA的转录组，结果比较分析发现，乌龟mtDNA可能至少有2个原初转录起始点，而平胸龟的原初产物转录起始点推测至少有4个，由此说明双控制区均具有转录起始的调控作用；基于单分子测序结果分析，平胸龟线粒体有多种特征的转录产物，其中还有在人类及果蝇线粒体中未见报道的ND5和 ND6AS（antisense）/tRNA-Glu，此可能是由于平胸龟ND5的重排所致。此外，还在平胸龟线粒体转录组中首次发现了CRII的成熟非编码LncRNA, 且检测到该LncRNA有选择性的多聚腺苷酸化。中国平胸龟生性凶猛，且主要分布在海拔较高、低温的山区溪流，这些结果显示重复控制区在该物种的进化上有重要的适应性意义；本研究为mtDNA重复控制区的进化与重组提供了新的资料，为动物线粒体进化和分子遗传学研究做出了贡献。