嗜热链球菌05-34胞外多糖的合成基因簇定向进化对发酵乳物性功能影响的研究

As a natural product, exopolysaccharide (EPS) from lactic acid bacteria not only can improve the rheological properties of fermentation products, but also has important physiological functions. So EPS becomes a hot research field of fermented dairy products. This project focuses on the directed evolution of EPS biosynthetic gene clusture to improve the textural properties of fermented milk. Then optimization and integration of gene clusters will be realized by gene selection of EPS gene cluster.The research content is as followings: Genes located in EPS biosynthesis pathway of lactic acid bacteria, which affect and determine chain length,branching structure and core region, are firstly cloned and expressed in the host strain Streptococcus thermophilus 05-34 producing exopolysaccharide. Then transformants with different combination of EPS synthetic gene cluster will be obtained. Furthermore,a series of transformed S. thermophilus strais, which cause the change of textural properties of fermented milk, will be directionally screened and then EPSs of the corresponding strains are extracted and purified.The structures of purified EPS are analyzed using HPLC, methylation - hydrolysis and HPLC-MS and so on, structural differences will be compared between different transformants. Meanwhile,the interaction between EPS and the casein micelles is investigated , then the relationship between function gene and physical property of fermented milk will be revealed. Finally, the function gene will be inserted into the EPS biosynthetic gene cluster in the host strain, then directional optimization of EPS synthesis will be realized.These results will provide a theoretical basis for improving quality of fermented milk.

乳酸菌胞外多糖（EPS）作为一种天然产物，不仅能改善发酵产品流变学特性，同时具有重要生理功能，成为发酵乳制品领域的研究热点。本项目以提升发酵乳质构特性的乳酸菌EPS合成基因簇的定向进化为方向，通过对EPS基因簇的基因选择，实现基因簇优化整合。研究内容首先是乳酸菌EPS合成途径中影响和决定链长度、分支结构和核心区域基因的克隆及其在产多糖宿主菌株嗜热链球菌05-34中进行表达，获得组合不同的EPS合成基因簇的转化菌株。定向筛选引起发酵乳质构特性发生变化的系列转化菌株，并提取纯化相应菌株中EPS。利用HPLC、甲基化-水解法和HPLC-MS等技术解析EPS结构，比较不同转化菌株EPS的结构差异。同时考察引起发酵乳质构特性发生变化的EPS与酪蛋白胶粒相互作用特性，解析功能基因与EPS物性功能的关系。最后将功能基因插入到宿主EPS合成基因簇中，实现EPS合成定向优化，为发酵乳品质提升提供理论依据。

乳酸菌胞外多糖(EPS)作为一种天然产物，不仅能改善发酵产品流变学特性，同时具有重要生理功能，成为发酵乳制品领域的研究热点。本项目以提升发酵乳质构特性的乳酸菌EPS合成基因簇的定向进化为方向，通过对EPS基因簇的基因选择，实现基因簇优化整合。为了获得大量的胞外多糖用于结构测定，本研究首先对嗜热链球菌05-34产EPS的培养条件及培养基组分进行优化，确定了05-34菌株产糖的最佳发酵条件，将其EPS产量提高至250 mg/L，是优化前的4.2倍。同时，检测其平均分子量为4.7 × 105 Da，与对照发酵条件相比提高了约9倍，单糖组成未发生改变。进一步的Real-time qPCR检测发现，EPS合成基因簇中参与链长控制的epsC基因在最佳发酵条件下的表达量较对照培养条件上调了2.7倍。此研究结果表明：培养条件和培养基组分的改变使嗜热链球菌05-34中EPS的产量提高的同时，其多糖分子量会随之变化，而这一变化可能是由链长控制基因的转录水平变化所导致。.为进一步探究嗜热链球菌05-34中EPS的生物合成机制，本研究通过测定其全基因组序列，对EPS合成基因簇进行定位和序列分析。结果显示05-34的染色体中一段约23.3 kb区域编码EPS合成基因簇，其中含有鼠李糖基转移酶基因epsF，而该糖残基并未出现于05-34的多糖结构中。本研究将epsF进行同源超量表达，导致05-34所产EPS分子量下降了6倍，同时epsC 基因的表达量下调1.9倍，说明epsF 基因通过影响链长控制基因 epsC 的转录水平导致了EPS分子量的降低。随后的EPS原位发酵酸乳实验表明，分子量的降低导致EPS的持水力、粘度降低，进而影响了酸乳的品质。为进一步阐明espC在EPS合成中的调控作用，本研究通过同源超量表达探究了epsC表达水平与EPS分子量之间的关系。结果表明，epsC超量表达菌株中胞外多糖的分子量提高2倍。随后的原位发酵酸乳实验表明，分子量的提升显著降低了酸奶在胶体脱水收缩敏感性，此变化有利于对抗加工运输中外界的机械力对酸乳结构的破坏。本研究明确了EPS合成基因簇中epsC和epsF基因对EPS特性的影响，并证实了通过调整EPS的生物合成途径来改变其结构这一思路是可行的。