miR-302通过CaN-NFAT信号通路调控心肌细胞肥大的分子机制

肥厚型心肌病（HCM）是临床常见的以心肌肥厚为主要特征的遗传性心肌疾病，确切的发病机制尚不明确。前期我们对HCM患者心肌进行miRNA检测，发现miR-302表达显著下调，而在扩张型心肌病患者心肌无明显改变。miR-302在胚胎干细胞表达丰富，但对心肌细胞的调节作用未见报道。生物信息学预测显示Calcineurin（CaN）调节亚基CnB是 miR-302的靶基因，沉默乳鼠心肌细胞miR-302后CnB表达升高，PE干预时与对照组比较，miR-302沉默组细胞肥大程度更重，CaN活性明显增强，故miR-302可能通过CaN-NFAT信号通路调控心肌细胞肥大。本项目拟通过过表达和沉默心肌细胞miR-302表达，确定其对心肌细胞肥大的调节作用及与CaN-NFAT通路的关系；采用荧光素酶报告基因技术证实其对CnB基因的调控机理；联合抑制和过表达CnB等方法明确其调控心肌细胞肥大的分子机制。

根据项目研究计划，对miR302的预测靶基因在人疾病心肌组织内表达进行了检测，对不同物种动物心肌组织和不同细胞株内的miR302的表达情况进行了检测，发现在HCM患者心肌内PPP3R1和AKT1基因表达明显升高，而miR302只有在人成年心肌细胞内存在一定水平的表达，在检测的其他物种成年心肌或细胞株内表达水平很低或检测不到，但在胚胎心肌（包括人和小鼠）都有高水平的表达。克隆和构建miR302前体表达载体和预测靶基因PPP3R1基因3’UTR载体，共转染HEK293细胞，通过对荧光素酶活性检测判断miR302是否与预测靶基因位点结合。结果证实miR302并不与预测靶基因直接结合发挥调节作用，与软件预测结果不符。针对以上实验结果，对研究内容进行了部分调整，重新克隆了miR302/367表达簇前体并构建表达载体，克隆另外两个预测靶基因AKT1和PI3K的3’UTR并构建载体，分别用miR302和miR302/367载体与PPP3R1、AKT1和PI3K 3’UTR载体共转染HEK293，结果亦显示，两个miRNA均不与预测的靶基因位点发生直接结合。在HEK293细胞内过表达miR302和miR302/367，检测PPP3R1，AKT1和PI3K基因的表达，结果未发现明显改变，亦证实该miRNA对预测靶基因无直接调控作用。综合以上结果，推测疾病心肌内检测到的miR302和预测靶基因的改变可能是通过间接发生作用而引起或是继发性的改变。通过本项目的研究，阐述了miR302在不同发育时期心肌和不同物种心肌内的表达特点，证实序列高度保守的miRNA在不同物种表达并不完全一样，可能发挥的调控作用也不完全相同。miRNA研究中常用的软件预测寻找靶基因与实际情况可能存在不符，而且实际机体内的信号调控是网络式的，除了直接的调控还会发生间接的影响。作为另外一部分调整和追加的研究内容，计划培养人的心肌细胞作为研究对象，进一步探讨miR302在人心脏内的调控作用和发生机制，后续工作将继续进行。该项目研究结果参加国内会议交流一次并做口头发言汇报，发表SCI论文3篇，协助培养博士和硕士研究生各一名。