生长激素调控鸡IGF-Ⅰ基因表达的分子机理研究

生长轴是动物体内从下丘脑-垂体-靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统。通过生长轴中提高GH和IGF-Ⅰ水平，促进增重、提高饲料转化率和改善肉品质，是畜禽生长调控的一种新途径。GH通过IGF-Ⅰ介导调节动物生长和细胞分化，因此，开展GH调控IGF-Ⅰ表达机理研究具有重要意义。本项目利用生物信息学的方法对鸡IGF-Ⅰ基因及其上游调控区约90kb序列分析，找出可能的STAT5结合位点，并通过细胞培养系统报告基因的检测、以及EMSA和ChIP等一系列手段和方法，从多角度验证鸡IGF-Ⅰ基因STAT5结合的增强子，从而通过对鸡IGF-Ⅰ基因内部以及上游STAT5结合位点的识别，探讨GH调控鸡IGF-Ⅰ表达的直接途径；通过对GH处理后肝脏富含转录因子表达变化、及其与鸡IGF-Ⅰ基因上顺式元件结合情况分析，探讨GH调控鸡肝脏IGF-Ⅰ基因表达的间接途径。从而研究鸡生长发育调控的分子机理。

本研究的主要目标是探讨GH调控鸡IGF-I基因表达的分子机理。首先利用生物信息学和VISTA程序对鸡IGF-I基因、5′及3′侧翼区约100 kb序列上的STAT5b结合位点进行分析，共发现57个STAT5b潜在结合位点，将其与人类相应序列比对，发现保守区域共有S26和S31两个STAT5b结合位点，其保守性大于70%。通过双荧光素酶报告基因检测系统检测这57个STAT5b结合位点中真正起增强子作用的位点，发现S15，S19，S26，S36和S53能够促进荧光素酶报告基因的表达；将这些位点突变后，荧光素酶表达活性显著性降低，进一步证实S15，S19，S26，S36和S53能够介导GH促进报告基因的表达。然后，通过ChIP和荧光定量PCR的方法分析GH处理鸡原代肝细胞后STAT5b与这5个结合位点的结合情况，发现抗STAT5b抗体使鸡IGF-I基因上S26位点得以富集，S26可能是STAT5b蛋白的潜在结合位点，体外GH处理可以增加STAT5b和IGF-I基因上S26位点的结合，但并没有发现其他四个位点与STAT5b蛋白结合，这一现象可能与GH处理后后不同的结合位点与STAT5b结合存在时间次序有关。而EMSA的结果发现S15、S19、S31、S36能与含有激活的STAT5b核蛋白结合，ChIP和EMSA结果不完全一致，其原因还需进一步探讨。在GH处理鸡原代肝细胞后，发现GH能调控IGF-I基因的表达，而肝脏核因子HNF家族成员HNF-1α、HNF-1β、HNF-3β基因的表达量在GH处理前后没有发生变化，结合在鸡IGF-I基因中未发现HNF结合位点，说明GH不是通过HNF的作用调控IGF-I的表达。此外，在原本实验设计的基础上还运用转录组测序的方法检测鸡原代肝细胞中受GH调控的基因，转录组测序获得的差异表达基因经过荧光定量PCR的方法进行验证，两者结果基本一致，表明转录组测序结果基本能真实的反应细胞内的状况。在GH处理组和对照组中共发现了164个差异基因，其中上调的有112个，下调的52个，这些受GH调控的基因功能主要集中在脂肪代谢及动物生长方面，还有分布在多个信号转导途径中。随机挑取受调控的基因分析发现都存在STAT5b结合位点，说明GH对其调控可能是受STAT5b介导的。这些结果初步揭示了GH调控鸡IGF-I基因表达的分子机制。