水稻抗病相关泛素E3连接酶OsBBI1靶标底物因子的分离鉴定及其功能分析

泛素/26S蛋白降解系统及其组分（如泛素连接酶E3等）在植物抗病反应中起重要作用。前期研究发现一个水稻泛素E3连接酶OsBBI1通过改变细胞壁抗病反应而调控对稻瘟菌不同生理小种的广谱抗病反应。本项目将研究OsBBI1互作因子/靶标底物因子及其功能，揭示OsBBI1调控水稻抗病反应的分子机制。运用酵母双杂交技术筛选鉴定OsBBI1互作因子；采用蛋白质组学技术比较分析bbi1突变体、OsBBI1超表达和野生型植株在稻瘟菌侵染前后的泛素化蛋白谱，筛选差别泛素化蛋白，获得得OsBBI1靶标底物因子。构建互作因子/靶标底物因子的RNAi和超表达水稻株系，比较分析稻瘟病病害表型及防卫反应（防卫基因表达、活性氧产生、细胞壁强化等）的变化，明确互作因子/靶标底物因子在稻瘟病抗病反应中的作用。研究结果将揭示水稻对稻瘟病不同小种广谱抗性的分子调控机理，为培育转基因抗病水稻新材料提供基因资源。

泛素/26S蛋白降解系统及其组分（如泛素连接酶E3等）在植物抗病反应中起重要作用。前期研究发现水稻泛素/26S蛋白降解系统的一个泛素连接酶OsBBI1通过改变细胞壁抗病反应而调控对稻瘟菌不同生理小种的广谱抗病反应。本项目重点研究了OsBBI1互作因子及其功能，运用酵母双杂交技术筛选鉴定出了OsBBI1互作因子水稻基质金属蛋白酶基因OsMMP1；纯化并获得重组OsMMP1融合蛋白，分析了重组OsMMP1蛋白的蛋白水解活性，结果表明OsMMP1蛋白具有基质金属蛋白酶的一般特征，既蛋白水解活性；构建互作因子OsMMP1的RNAi和超表达水稻株系，比较分析了生物和非生物胁迫下的表型及其相关基因的变化，结果表明OsMMP1在水稻的生物（白叶枯病菌）和非生物胁迫（干旱、）响应中均扮演者重要的作用。研究结果将揭示OsBBI1调控水稻对稻瘟病不同小种广谱抗性的分子机理，为培育转基因抗病水稻新材料提供基因资源。. 此外，运用生物信息学方法在蛋白数据库中鉴定发现一类非常保守的未知功能蛋白，并且推测这些包含保守结构域YTH的蛋白可能具有RNA结合的活性。为了深入了解这些含YTH结构域蛋白的生物学功能，我们运用生物信息学方法在拟南芥和水稻基因组中分别鉴定了13和12个基因，命名为AtYTH01~13和OsYTH01~12。这些结果表明在高等植物中含有YTH结构域的蛋白组成一个相对较小的基因家族。将AtYTH05和AtYTH07的编码区ORF克隆进原核表达载体，纯化获得重组的蛋白。凝胶阻滞试验的结果发现重组的AtYTH05融合蛋白能够在体外与单链RNA相结合，表明YTH蛋白具有RNA结合活性。同时，我们也结合基因芯片和RT-PCR的方法分析了水稻和拟南芥YTH家族所有成员的表达模式，结果显示水稻和拟南芥YTH家族基因的表达都存在着组织和时空的特异性。GUS染色结果显示AtYTH05和AtYTH07的表达受开花的强烈诱导，这与RT-PCR的结果相一致。我们还运用基因芯片数据分析了水稻和拟南芥YTH家族基因在生物和非生物胁迫以及激素处理条件下的表达模式，数据表明不同的YTH家族成员在植物的生长发育，生物/非生物胁迫以及激素处理下扮演的不同的角色，是一个新的RNA结合蛋白类群。.