自噬双重作用调控维持大鼠肺移植供肺细胞线粒体内稳态减轻I/R损伤的实验研究

Our previous studies have shown that autophagy is involved in the process of ischemia reperfusion (I/R) injury in the rat lung after lung transplantation, and the inhibition of autophagy can reduce the apoptosis of allograft and improve pulmonary function. However, the role of autophagy in the lung I/R injury is not clear. We found that autophagy plays a protective role in hypoxia injury in vitro, but harmful in the hypoxia/reoxygenation. Combined with other studies, we hypothesized that the dual role of autophagy is closely related to the level of autophagy, and moderate autophagy protects cells, while excessive autophagy promotes cell death. The project intends to adopt the rat lung transplantation,pulmonary microvascular endothelial cells in vitro for I/R lung injury, ischemia time after lung transplantation surgery for lung gradually extended, induce different degrees of autophagy, and then bidirectional regulation of autophagy, in the attempt to reveal the dual role of I/R damage in different time of ischemia reperfusion lung. Investigated whether there is a reasonable range of autophagy and autophagic dual role translated level. To explore through the detection of autophagy, keeps reasonable dual role in regulation of autophagy, inhibit excessive autophagy to maintain cell homeostasis, inhibit cell death, reduce lung I/R injury, improve pulmonary function

我们之前的研究表明：自噬作为一个细胞自稳过程参与了大鼠肺移植供肺缺血再灌注（I/R）损伤，抑制自噬可减轻供肺I/R后细胞凋亡、改善肺功能。然而，自噬在供肺I/R损伤中的作用尚不明确，我们在体外试验中发现自噬在单纯缺氧损伤起到了细胞保护作用，而在复氧损伤中则加重了细胞损伤。结合他人研究，我们推测自噬的双重作用与自噬水平密切相关，适度自噬保护细胞，而过度自噬促进细胞死亡。本项目拟采用大鼠原位异体肺移植模型、肺微血管内皮细胞体外培养模拟供肺I/R损伤，以供肺逐渐延长的缺血时间，诱发再灌注后不同程度的自噬；同时双向调控自噬，试图揭示自噬在供肺不同缺血时间再灌注后I/R损伤中的双重作用，研究是否存在合理自噬的范围及自噬双重作用转化的水平节点，探索通过检测自噬水平，调控自噬双重作用即保留合理自噬，抑制过度自噬来维持肺微血管内皮细胞内稳态，抑制细胞死亡，减轻供肺I/R损伤，改善肺功能。

遵实验设计，本项目在前期研究已证实在大鼠原位肺移植模型中，抑制自噬可减轻供肺I/R后细胞凋亡、改善肺功能的基础上进一步深入研究，从体内、体外两个方面入手，通过线粒体自平衡及线粒体自噬这一新的方向，初步研究并试图阐明自噬调控（包括药物及基因水平干预）对供肺及肺微血管内皮细胞的线粒体功能及自噬的影响。具体如下：.1、证实延长供肺冷缺血及再灌注时间均可上调供肺自噬及线粒体自噬水平；延长供肺冷缺血及再灌注时间先抑制移植肺中氧化磷酸化水平在冷缺血6小时达到波谷，随后持续上升；移植肺中糖酵解水平随供肺冷缺血及再灌注时间延长而上升，在冷缺血6小时组达到峰值，随后逐渐下降；移植肺中ROS产量随供肺冷缺血及再灌注时间延长而上升，在冷缺血6小时组达到峰值，随后逐渐下降；延长供肺冷缺血及再灌注时间可诱导mTOR信号通路磷酸化；ROS通过mTOR信号通路抑制移植肺中的自噬水平；.2、建立大鼠左肺原位移植模型，探讨线粒体自噬在肺移植后I/R损伤中的作用。用3-MA和雷帕霉素处理供体肺，在冷缺血保存和再灌流的不同时间段检测线粒体自噬、肺功能和细胞凋亡。发现在肺缺血开始时，线粒体自噬可以抑制细胞的凋亡，但当线粒体自噬达到正常水平时，细胞凋亡就失去了控制。供体肺I/R后，线粒体自噬增加至再灌注6h后逐渐降低。线粒体自噬增加伴随细胞凋亡增加，肺损伤加重，肺功能恶化。此外，3-MA抑制线粒体自噬可抑制供体肺细胞的凋亡，从而减轻I/R所致的肺损伤，抑制H/R诱导的PMVEC的凋亡，促进其增殖。最后，mTOR通路参与了I/R和H/R介导的线粒体自噬对细胞凋亡的调控。抑制I/R诱导的线粒体自噬可通过mTOR信号通路减轻肺损伤，提示一种潜在的肺I/R损伤的治疗策略。.此外，在完成原定实验计划的基础上，进行了一系列探索性研究，具体如下：.1、基于GEO数据库，收集肺移植受体第三支气管分支黏膜活检样本mRNA数据集，利用生物信息学分析筛选基因改变和识别在肺移植排斥反应中起关键作用的枢纽基因；.2、基于生信分析，尝试探索miRNA-223在肺移植缺血再灌注损伤中调控自噬的作用机制，在动物及细胞水平均证实肺移植中miRNA-223高表达的前提下，证实miRNA-223通过抑制HIF2α的表达，上调自噬水平，加重肺缺血再灌注损伤。.3、基于生信分析，尝试探索miRNA-145在肺移植缺血再灌注损伤中调控自噬的作用机制.