microRNA172及其靶基因在蝴蝶兰成花诱导中的作用机制研究

Commercial cultivation of Phalaenopsis is in the largest quantities among the orchid family. The increasing production cost, resulted from cool-temperature-supplied for floral bud dormancy releasing, has inhibited the sustainable development of the commercial production in Phalaenopsis. Plant microRNAs are embedded in regulatory networks of flowering induction. Well-known miR172-targets node, regulating the amplitude of floral gene expression, plays a pivotal role in regulation of flowering time in plants. Based on the isolation of candidate miR172-targeted genes and the well-established efficient transformation system, our group is going to make morphological and flowering time observation, as well as temporal-spatial expression analysis and further correlation examination of miR172 and miR172-targeted genes, both in the miR172-deficient mutant of Phalaenopsis and its control, which are both treated with fluctuating day(12h)/night(12h) cool temperatures. Investigation of the function of miR172 and miR172-regulated genes involved in flowering induction would promote elucidating the complicated mechanism of cool-induced flowering, and further wide application of transgenic plants for temperature breakthrough of inflorescence initiation in Phalaenopsis.

蝴蝶兰是商业化栽培面积最大的兰科植物，但成花诱导过程中对"特殊低温"的独特要求以及由此产生的高成本已成为制约该产业持续发展的瓶颈。近几年的研究表明microRNAs在植物成花诱导方面发挥重要的调节功能，其中microRNA172（miR172）通过作用其靶基因，直接影响下游开花关键基因的表达幅度，调控植物的开花习性。前期研究表明蝴蝶兰miR172参与成花调控，但其调控机理及靶基因作用机制并不清楚。本项目依托已经建立的高效蝴蝶兰转基因体系，通过构建蝴蝶兰miR172干涉突变体，在可变低温条件下，观测突变体与正常植株的表型和成花习性；分离并鉴定蝴蝶兰低温成花诱导中miR172的靶基因；分析蝴蝶兰miR172及其靶基因的相互作用模式，解析miR172与其靶基因在蝴蝶兰成花调控途径中的作用机制，以期采用基因工程手段实现蝴蝶兰开花时间的人工控制、突破开花温度的限制瓶颈，推动蝴蝶兰产业的可持续发展。

朵丽蝶兰（Doritaenopsis hybrid）是朵丽兰（Doritis）与蝴蝶兰（Phalaenopsis）的杂交后代，具有重要的经济价值，同样存在亲本的低温成花诱导特性，而由此产生的高成本成为制约其持续发展的瓶颈。microRNAs在植物成花诱导方面发挥重要作用。microRNA172（miR172）通过负调控其靶基因，参与植物成花调控。为此，本研究开展以下三个方面的工作。一是分离朵丽蝶兰miR172的前体（MIR172）及其靶基因。通过同源克隆（结合RACE）技术，分离获得2个朵丽蝶兰MIR172同源序列DhMIR172-100和DhMIR172-211（GenBank No. KY612333 ），以及5个靶基因全长（或部分）cDNA序列DhAP2-1（KY612331）、DhAP2-2（KY612334）、DhAP2-3（KY612335）、DhTOE1和DhTOE2。二是解析朵丽蝶兰低温成花过程中miR172与低温，与靶基因，以及与GI、CO、FT等开花途径重要基因表达的相关性。以高温处理（30℃/25℃；day/night）为对照，对朵丽蝶兰进行低温（22℃/18℃）诱导，DhmiR172的表达与低温信号之间存在显著的正相关，并在嫩叶花梗中特异表达；与靶基因DhAP2-1（r = -0.973**）、DhTOE1（r = -0.955**）和DhTOE2（r = -0.739**）的表达呈极显著的负相关；与DhCO和DhFT表现为极显著的正相关，但与DhGI则表现为极显著的负相关。三是通过转基因的方法验证DhmiR172的功能。在反义转基因拟南芥中已经获得明显的晚花型植株，表明DhmiR172可以调控拟南芥的开花时间。转基因蝴蝶兰目前获得阳性转基因类原球茎多枚，但尚未分化成植株，相关检测工作正在进行中。