在肺纤维化中虎杖通过靶向结合ELA2削弱Notch剪切抑制Notch信号通路介导肺泡上皮细胞EMT的分子机制研究

For more than ten years, our research group has been studying the effect of Polygonum cuspidatum on pulmonary fibrosis (PF). The results or our previous studies showed that Polygonum cuspidatum plays an inhibitory role in PF, and further results of molecular biology showed that Polygonum cuspidatum could inhibit TGF-β1-induced EMT, which is closely related to the inhibition of Notch pathway activation. However, the specific mechanism of Polygonum cuspidatum on Notch pathway regulation is unclear. By searching ChEMBL and BindingDB (two network databases based on experimental binding of target protein and active ligand compound), it was found that emodin, the main component of Polygonum cuspidatum, could bind to ELA2 to inhibit its activity, so as to suppress Notch shear and the nuclear translocation of Notch intracellular domain. In the present study, we proposed to investigate the Polygonum cuspidatum extract and emodin can inhibit ELA2 by binding, and to attenuate Notch shear to inhibit Notch pathway activation from the following three levels: TGF-β1 induced epithelial EMT, PF animal model and interaction of biological small molecules and proteins. Our study will provide a more direct theoretical basis for the effect of Polygonum cuspidatum on PF.

本课题组近十余年来致力于研究虎杖对肺纤维化的作用，结果表明虎杖对肺纤维化有良好的抑制作用。结合分子生物学技术进行实验的结果进一步显示虎杖提取物可通过抑制TGF-β1诱导的EMT，且此过程与虎杖对Notch通路激活的抑制有密切关系，但虎杖对Notch通路调控的具体机制却不清楚。通过搜索数据库，发现虎杖主要成分大黄素可与ELA2结合抑制其活性，从而削弱Notch的剪切，抑制Notch胞内段的核转位。而ELA2与肺纤维化关系密切。综合上述研究，提出假说：中药虎杖可通过与ELA2靶向结合，抑制ELA2的活性，削弱Notch剪切过程，抑制Notch通路活性，从而抑制TGF-β1诱导的EMT，达到抑制肺纤维化的作用。本项目拟从TGF-β1诱导上皮细胞的EMT、肺纤维化动物模型和生物小分子与蛋白相互作用三个层面来证明此假说。该研究将为虎杖对肺纤维化的作用提供更加直接的理论依据。

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一种纤维增生性疾病。据报道，肺泡Ⅱ型上皮细胞向成纤维细胞的转化会导致和/或加重肺纤维化，其特征在于成纤维细胞增殖，细胞外基质（ECM）的产生和沉积，肺泡壁损伤和功能性毛细血管丢失。中医药在防治肺纤维化上积累了丰富的经验，颇具特色和优势。本课题组前期的研究成果表明虎杖能通过抑制Notch介导的肺泡上皮细胞间质化（EMT）过程，从而延缓肺纤维化过程，为虎杖治疗肺纤维化提供了一个新的靶点。本研究继续探讨虎杖是如何调控Notch通路，明确其具体分子机制。大黄素为虎杖的主要成分，通过网络数据库检索，发现大黄素存在多个靶蛋白相互作用，其中包括弹性蛋白酶-2（Neutrophil elastase, ELA2）。由此推测虎杖主要成分大黄素可通过与ELA2结合，抑制ELA2的活性，削弱Notch剪切过程，抑制Notch通路活性，从而抑制EMT过程，进而延缓肺纤维化进程。研究内容包括：（1）通过体内动物实验明确虎杖对Notch信号通路及EMT的影响；（2）通过体外细胞实验探讨ELA2是否介导虎杖主要成分大黄素调节Notch剪切和肺泡上皮细胞EMT；（3）通过体外细胞实验探讨ELA2剪切Notch1影响Notch通路调控肺泡上皮细胞EMT；（4）体外实验验证Notch1通路对大黄素调节ELA2诱导的EMT的影响。研究成果包括：（1）发现虎杖可能通过抑制Notch1通路活性（Notch1剪切）调节EMT进而影响肺纤维化进程；（2）明确ELA2通过剪切Notch1调控Notch通路活性及肺泡上皮细胞EMT；（3）明确大黄素通过抑制ELA2酶活性对Notch剪切及EMT产生影响；（4）明确抑制Notch1通路进一步增强了大黄素对ELA2诱导的EMT的作用。综上，该研究成果首次证明了虎杖主要成分大黄素可能通过与ELA2相互作用，影响Notch1的切割和Notch1的核易位，抑制EMT过程，进而延缓肺纤维化进程的分子机制。本项目深入研究虎杖抑制肺纤维化的作用机理，为临床中运用虎杖防治肺纤维化提供了有力的实验数据，并且为继续深入挖掘虎杖抗纤维化作用的作用机制奠定了基础。