三种吴茱萸属植物中新型吲哚喹唑啉生物碱的发现及其抗真菌活性研究

The project aims at solving the lack of anti-deep fungal drugs, serious side-effect, drug-resistance and other problems in the clinical therapy. Applicant's prior studies on the constituents of E. rutaecarpa have found that the new structure type alkaloid dievodiamine (Er-1) has significant antifungal activity, then we select Evodia genus plants rich in indole quinazoline alkaloids as the research object, applying with the separation-oriented 1H-NMR and LC-MS technology and adopt the minimum inhibitory ccentration (MIC) constracting with positive control as an activity evaluation system in order to confirm a new structure type of bisindole quinazolinone alkaloids fastly and efficiently as the active ingredients representatively. Analysing the results of virtule design by the auxiliary software - drug discovery studio 3.1 help to our chemical modification so that we can prepara a series of new indole quinazoline alkaloid derivatives. In addition, we will try to explore the antifungal structure-activity relationships (SAR) of the indole quinazoline alkaloid and its derivatives, clarifying their inhibition enzyme activity on the Lanosterol 14α Demethylase (CYP51) from the cellular and molecular level research using of flow cytometry instrument, Roman spectrum and GC-MS ect. As expected, one or two highly effective, safe lead compounds will be found. Our project not only provide new idea about scientific utilization of evodia plants, but also make the theory basis in the research and development of anti- fungal infection innovative drugs.

针对目前抗深部真菌感染药物缺乏、副作用大、易产生耐药性等问题，同时鉴于申请者前期研究发现新结构类型化合物双吴茱萸碱（Er-1）具有显著抗真菌活性，本项目拟选择富含吲哚喹唑啉生物碱的吴茱萸属植物为研究对象，运用1H-NMR、UPLC/Q-TOF/MS技术导向分离，采用最低抑菌浓度、相对抑酶活性及与阳性药对照耐受性好为评价体系，高效快速地分离到新型吲哚喹唑啉类活性成分；利用药物辅助软件Discovery studio 3.1虚拟筛选，指导结构修饰，制备系列新吲哚喹唑啉衍生物；采用流式细胞仪、Roman光谱和GC-MS等测定方法从细胞和分子水平上研究吲哚喹唑啉生物碱及其衍生物对靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）的抑酶活性，全面阐明吲哚喹唑啉生物碱抗真菌的构效关系；发现1-2个高效、安全的抗真菌先导化合物，为研制抗深部真菌感染创新药物提供理论依据，也为吴茱萸属植物的科学利用提供新用途。

本项目在前期工作基础上，对富含吲哚喹唑啉生物碱的吴茱萸（Evodia rutaecarpa）、牛紏吴萸（E. trichotoma）和臭檀吴萸（E. daniellii）3种吴茱萸属植物进行了深入系统的化学研究。建立了基于1H-NMR和UPLC/Q-TOF/MSn的吲哚喹唑啉生物碱分析追踪技术，并结合多种现代分离和波谱鉴定技术从上述三种植物中分离鉴定了116个化合物（其中吲哚喹唑啉类生物碱45个），包括21个新化合物。借助计算机辅助药物设计软件AutodockVina，对吴茱萸次碱和羊毛甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）进行了分子对接，根据对接实验结果设计合成了28个新的吲哚喹唑啉生物碱衍生物，扩大了药物筛选的化合物来源。采用MIC法测定了选取的33个生物碱对12种人体耐药真菌的活性，发现新结构类型的化合物（+）双吴茱萸碱对人体耐药菌株红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）和裵士着色菌（Chromomycosis）的MIC值分别为16和32 µg/mL，优于阳性对照药两性霉素B的32和128 µg/mL；对人体耐药菌株孢子丝菌（Sporidium）的MIC值为32 µg/mL，与阳性对照药两性霉素B的效果相当。采用菌丝生长速率法和比浊法对分离及合成的生物碱进行体外抗植物病原菌活性筛选，结果显示（+）双吴茱萸碱对七种测试真菌菌丝生长的EC50值均低于10 μg/mL，对两种细菌水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）的EC50值仅为2.34和2.74 μg/mL。通过MTT法对分离及合成的化合物进行了体外抗肿瘤活性筛选，发现吴茱萸碱具有较好的抗肿瘤活性，对HeLa细胞IC50为0.68μM。目前，本项目共发表标注的SCI论文7篇，核心期刊7篇；申请国家发明专利8件，其中授权4件。以上结构新颖并且具有显著生物活性的吲哚喹唑啉生物碱的发现，进一步丰富了天然来源的喹唑啉生物碱结构类型，为具有自主知识产权的新抗真菌药物和植物源杀菌剂的研发提供了优良的先导化合物，也为吴茱萸属植物的科学利用奠定了坚实的基础。