MicroRNAs调控RORA在间充质干细胞微囊促缺血心脏血管新生中的新机制

Mesenchymal stem cells (MSC) transplantation has been shown to be safe and effective for the treatment of ischemic heart disease.However, low survival rate of grafted cells made the underlying mechanism elusive. Our recent studies have found that: 1. MSC could release numerous extracellular vesicles (EVs) upon hypoxia stimulation, which could be internalized into endothelial cells (EC). 2. MSC-EVs exhibited potent angiogenesis- promoting activities both in vivo and in vitro. 3. Differential microRNA (miRs) array analysis hinted that retinoid-related orphan receptor alpha (RORA) was the target gene of the miRs specifically inclusive in MSC-EVs compared with those from the parent MSC. RORA has been proved to play a vital role in post-ischemic angiogenesis. Therefore, it is postulated that these specific miR-mediated regulation on RORA might be the key pathway responsible for repairing the damaged heart by MSC-EVs. To testify this hypothesis, the regulatory mechanisms of miRs on RORA will be investigated by using specific miR mimics or inhibitors and gene transfer with lentiviral vectors carrying wild and mutant RORA. The molecules involved in the RORA pathway will also be identified. The mechanisms will be further verified by investigations on the improving angiogenesis effects of MSC-EVs on rat ischemic hearts by using EVs containing abundant or deficient specific targeted miRs. The study here will not only explore MSC’s new epigenetic regulation mechanisms mediated by EVs, but also may implement the possible future interventional targets for ischemic heart disease.

间充质干细胞治疗缺血性心脏病安全有效，然而，移植细胞在体内存活率低，其组织修复的机制如何目前尚不清楚。我们的前期研究发现:1.缺氧条件下MSC释放大量细胞外微囊（EVs），并能被内皮细胞摄取；2.MSC-EVs具有体内外促血管新生功能；3.微阵列分析提示，MSC-EVs所含差异microRNA（miRs）的靶基因可能是维甲酸相关孤儿受体α（RORA），一种低氧诱导血管新生中重要的负调控因子。因此，MSC-EVs中miRs调控RORA基因转录，启动血管新生，可能是MSC缺血心脏修复的分子机制。为验证这一假设，我们拟采用miRs模拟物及抑制剂，RORA基因野生型及突变型慢病毒载体等方法，研究miRs对内皮细胞RORA基因及下游分子通路的影响；探索通过调控MSC-EVs中miRs表达，促进心肌梗死大鼠血管新生疗效的可行性。课题将研究MSC促血管新生的表观遗传学机制，为缺血性心脏病治疗探寻新途径。

基础及临床研究均证实，间充质干细胞（MSC）移植能改善缺血性心脏病的心功能，然而，移植细胞在体内存活率低，其组织修复的机制尚不清楚。我们的前期研究发现：1.缺氧条件下MSC释放大量细胞外微囊（EVs），并能被内皮细胞摄取；2.MSC-EVs具有体内外促血管新生功能；3.微阵列分析提示，MSC-EVs所含差异microRNA（miRs）的靶基因可能是维甲酸相关孤儿受体α（RORA），一种低氧诱导血管新生中重要的负调控因子。因此，我们提出，MSC-EVs中miRs调控RORA基因转录，启动血管新生，可能是MSC缺血心脏修复的分子机制的科学假设。通过一系列体内外研究，我们验证了这一科学假设。具体研究结果包括：1、通过对缺氧预处理后MCS-EVs中差异miRs表达谱的生物信息学分析、文献调研及细胞学RT-PCR验证，筛选出与血管新生密切相关的“miR-27a-3p-RORA”调控网络之一，作为本研究的主题；2、采用miR-27a-3p模拟物及抑制剂，构建携带RORA的野生型及突变型慢病毒载体等方法，通过细胞学研究确定miR-27a-3p与RORA的互作关系；3、通过体外细胞实验，研究miR-27a-3p表达对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移及管状结构形成等成血管作用的影响，并验证了miR-27a-3p抑制RORA基因的转录，促进eNOS、Akt、ERK1/2的表达，可能是其促血管新生的分子通路；4、构建携带miR-27a-3p的慢病毒载体，感染MSC，建立富含miR-27a-3p的MSC-EVs的稳定生产体系（MSC-miR-27a-3p-EVs），通过HUVEC体外成血管实验及急性心肌梗死小鼠模型，验证了MSC-miR-27a-3p-EVs的促血管新生，及对缺血心脏的保护作用。总之，缺氧预处理MSC，可通过EVs传递miR-27a-3p，负向调控RORA表达，激活eNOS的分泌，发挥体内外促血管新生的作用，而这一作用可能是通过激活Akt、ERK1/2等通路而实现的；应用基因工程技术生产miR-27a-3p过表达的增强型MSC-EVs，可增强MSC-EVs的体内外促血管新生作用，更好的保护缺血心肌。研究结果为了解缺氧预处理MSC促进缺血损伤修复的机制提供了实验依据，为缺血性心脏病的无细胞治疗，工程化EVs递送分子药物在疾病干预中的应用，提供了新的方法和思路。