CXCL2和CXCL5趋化的小鼠肿瘤相关中性粒细胞的表型分子筛选和作用机制研究

As the effectors in innate immune response forming the first line of defense against bacterial and fungal pathogens, neutrophils are also the effector cells for antibody-based tumor immunotherapy. However, the tumor associated neutrophils (TANs) take an anti-tumorigenic versus a pro-tumorigenic phenotype. Lack of the phenotype marker and uncertain about the action mechanism of TANs will take risks on the application of tumor immunotherapy. We have found that CXCL2 inhibited the tumor growth in nude mice and CXCL5 contributed to the tumor growth and metastasis in vivo by recruiting TANs without altering in vitro proliferative and invasive ability. To identify the underlying molecular mechanism of these two types of TANs, we will sort the anti-tumorigenic TANs recruited by CXCL2 and the pro-tumorigenic ones mediated by CXCL5, then use RNA-Seq and biological information analysis to compare the expression profile and build the data base of the differential gene expression between them. Find the relationship between the gene expression with the function using bio-informational analysis and the function experiments in vitro. And the membrane proteins will be focused on to screen the special molecular phenotype. These will provide the molecular base to make sure the real function of neutrophils in the tumor biology. Meantime, The KEGG pathway database combined the molecular biology technique will be used to find the signal pathway of the TANs activated by CXCR2 binding CXCl2 and CXCL5 respectively, which will make it possible to change TAN from N1 to N2 type, and help to develop the tumor immunotherapy.

中性粒细胞是天然免疫的第一道防线，也是肿瘤抗体治疗的效应细胞，具有临床应用潜力。然而肿瘤组织浸润的中性粒细胞（TANs）却存在抑制肿瘤和促进肿瘤两种类型。这两类TANs的不易区分和功能机制的不明确，增加了应用肿瘤免疫治疗的风险。我们前期发现，CXCL2 趋化的TAN抑制肿瘤的增殖，而CXCL5趋化的TANs有促癌作用。为了明确这两种中性粒细胞的功能差异及其作用机制，本课题分选出受这两种因子各自趋化的小鼠TANs，采用RNA-Seq建立差异基因表达数据库，通过生物信息学分析和体外功能实验明确其基因表达与功能的相关性，并针对膜蛋白筛选特异的表型分子，为阐明中性粒细胞在肿瘤生物学中的功能提供分子基础；同时通过对数据库的GO和KEGG分析结合分子生物学技术阐明这两种趋化因子结合同一受体而激活TAN发挥不同功能的信号通路，为调控促癌性TANs向抑癌TANs的转化，发展肿瘤免疫治疗提供新的策略。

作为天然免疫的第一道防线，中性粒细胞已被发现是肿瘤抗体治疗的新型效应细胞。然而，肿瘤组织的中性粒细胞（TANs）存在抑制肿瘤(N1型）和促进肿瘤（N2型）两种类型，且这两类细胞的区分标志和功能机制的不确定性限制了中性粒细胞在临床上的应用。为了明确这两类中性粒细胞的功能差异，本项目基于前期工作趋化因子CXCL2趋化的中性粒细胞抑制肿瘤增殖，而CXCL5趋化的中性粒细胞具有促癌作用的发现。分别建立了稳定表达这两种趋化因子的肝癌细胞，通过细胞水平和动物水平实验验证了前期结果；采用流式分选技术分离两类中性粒细胞。经细胞染色发现他们都是含有成熟型和未成熟型的混合细胞群，一方面体现肿瘤微环境中中性粒细胞成分复杂。另一方面也提示现有的区分中性粒细胞的标志物不能进行良好的区分促瘤型和抑瘤型中性粒细胞。将这两种趋化因子招募的肿瘤相关中性粒细胞提取mRNA，进行建库和转录组测序。经生物信息学分析，结果显示两类细胞有大量差异表达的基因。我们对这些差异基因的GO富集分析和KEGG分析，发现CXCL2组的差异表达基因富集中在天然免疫和炎症反应的注释条目，这与抑癌型肿瘤相关中性粒细胞通过分泌促炎因子杀伤肿瘤细胞的研究报道相一致，而富集的信号通路包括凋亡和NK细胞介导的细胞杀伤，这些信号通路上的差异表达基因成为区分抑癌型和促癌型肿瘤相关中性粒细胞的关键分子。此外，我们比较了两类细胞差异表达的膜蛋白，按照差异程度进行排列组合，筛选出一个含有3个在这两类肿瘤相关中性粒细胞中差异显著的膜蛋白组合作为分选这两类细胞的区分标志物。通过该项目的实施，我们发现了对肿瘤有促进和抑制作用的两类肿瘤相关中性粒细胞的转录组学特征。我们对这些特征的分析和发现有利于调控促癌性肿瘤相关中性粒细胞向抑癌性中性粒细胞转化，推动了中性粒细胞在肿瘤免疫治疗中的发展和应用。