EGCG引导骨再生膜的骨免疫调节研究

Collagen membranes play a pivotal role in guided bone regeneration (GBR), which is widely utilized in bone increment and expand implant indications. Nevertheless, implantation of those possible enable implant into failure owing to the imbalance of foreign body reaction (FBR). Therefore, how to design immune regulation materials and further regulate FBR is the key. In previous studies, we fabricated an EGCG modified collagen membrane that could regulate secretions of inflammatory factors of osteoblasts and possessed the abilities to induce M1/M2 macrophages polarization and sequentially promoted tissue regeneration. This study intends to further explore the regulation ability of EGCG modified collagen membranes on FBR and the role of immune cells. Besides, in the view of outcome of macrophages polarization in inflammatory tissue for the first time, an EGCG modified collagen membranes for tissue repair in GBR by mediating M1/M2 macrophages polarization will be studied. The biological characteristics and mechanism of signal transduction, mediated by mTOR site dependent pathway, of the EGGC-collagen membranes will be evaluated in vitro by identification of macrophage markers, cytokines and CRISPR gene editing. Mouse calvarial defects models will be established. Flow cytometry, histomorphological analyses, immunofluorescence analyses, qPCR and western blot will be used to evaluate the outcome of tissue regeneration, which are consistent with the results of experiments in vivo. This program will discuss the outcome of inflammatory tissue creatively, and provide innovative strategy and lead to ultimately outcomes in application of GBR.

胶原膜在广泛应用于骨增量的引导性骨再生术(GBR)中起到了关键的作用。然而，胶原膜植入机体后会引起巨噬细胞介导的异物反应(FBR)的发生。不平衡的FBR会引起骨吸收，造成手术失败。因此，关于如何设计免疫调节材料，进一步调控FBR是问题的关键。在我们前期研究中发现EGCG改性的胶原膜可调节炎性因子的分泌，并具有促进巨噬细胞M1-M2极化的潜能。本课题拟进一步探究EGCG改性的胶原膜对FBR的调节能力并探究免疫细胞的变化。进而以FBR中的巨噬细胞为切入点，采用EGCG改性胶原膜介导巨噬细胞极化，以期引导骨再生，通过表型鉴定、细胞因子分泌鉴定、相关基因表达等技术评价该免疫调节材料的体外生物学性能及其在mTOR位点依赖性通路介导下的潜在分子转导机制;采用组织形态学、免疫荧光分析、相关蛋白及基因表达等手段探讨EGCG改性的胶原膜植入小鼠颅骨缺损模型后引导骨再生效果，为免疫调节GBR膜提供新的思路。

牙齿缺失以后，牙槽骨均会产生不同程度的吸收和萎缩。随着时间推移，吸收情况愈加的严重，造成种植位点骨量不足，使得种植体无法获得良好的初期稳定性，影响种植体骨结合，造成不佳的修复效果。随着种植修复的进展，，其中胶原屏障膜在一期愈合伤口闭合和空间的维持是引导骨组织再生问题的关键。思考如何透过自体免疫能力促进组织再生，在早期调节免疫反应、后期促进组织再生，实验证实该材料植入体外具有一定的屏障、促进细胞活力及免疫调节效果，观察到改性材料具有降低炎性细胞因子分泌的功能，并且对特定的蛋白酶具有降低分泌水平的作用，由于材料植入体内后一系列的免疫排异反应将影响材料是否能够成功促进组织再生，因此评价植入后的异物反应是决定材料再生的关键因素，良好的异物反应过程将导致局部骨组织的再生，然而不良的异物反应将导致局部组织的纤维化，影响骨组织的再生。因此将材料植入体内皮下软组织及颅顶骨硬组织缺损，进一步观察是否具有免 疫调节效应，了解是否能够诱导促进组织修复的免疫细胞聚集，并表达再生相关的细胞标志物，进一步证实具有促进修复型巨噬细胞亚类的聚集，流式细胞学及组织学结果证实该材料能够促进体内巨噬细胞的聚集，并进一步表达促进修复的标志物表型，且共定位到局部因子的表达。进一步观察局部骨组织是否良好分化，透过骨组织分化标志物染色观察到局部组织具有特异性标志物的表达。由此可见，在材料的刺激之下骨组织良好的分化。在此基础上，我们进一步探究材料周围的免疫微环境、分析材料的免疫调节能力与组织修复的相互作用。对样本进行了单细胞测序，注释了材料周围组织中所有的细胞类型。发现在免疫细胞的数量上，材料组的巨噬细胞、中性粒细胞少于空白对照组，而效应 T 细胞增多。通过相关性检验和分化轨迹分析判断了各亚群之间的分化关系。