1型神经纤维瘤病遗传资源库的建立及发病分子机制研究

Neurofibromatosis 1 (NF1) is highly variable expressed and caused by mutations in the NF1 gene. Due to high mutation rate, large size and the presence of pseudogenes, detecting mutation effectively in NF1 gene used to be a technical difficulty in the study of the disease, and therefore mutation analysis in NF1 gene has been the research foucs of NF1 in the world. To date, more than 1050 mutations in NF1 gene have been reported and less than 100 of them were identified in Chinese Han population. Moreover, a few studies in Chinese mainland were all individuals studies which were completely uncoordinated with our large population. As mutation detection technologies advance, the detection rate in some large cohort studies has been on the rise and some genotype-phenotype correlations were indicated. In this study, we intend to establih a genetic resource of NF1 in Chinese Han population and build an rapid, accurate and cost-effective testing system by use of a combination of original RNA-based cDNA-PCR mutation detection method, DHPLC, MLPA and DNA direct sequencing, and therefore complete a first large cohort study on mutation analysis of NF1 gene in Chinese Han population to investigate the molecular mechanism of NF1.

I型神经纤维瘤病(NF1)的致病基因为NF1基因，该病临床表现复杂，NF1基因大、自发突变率高并存在多个假基因，一直以来对该基因有效的突变鉴定被视为本病研究的一个技术性难点，也因此NF1基因的突变研究一直成为国内外研究该病的热点。迄今已报道的NF1基因突变种类已逾1050种，但与中国汉族人相关的不足百种，且国内少有的研究都限于个别报道，这与我国人口众多极不协调。随着突变检测技术的发展，NF1基因的突变检出率在一些大样本的突变检测研究中得到不断提高，同时相关的基因型与表型的关联性也被逐渐提示。本研究意在建立中国汉族人NF1的遗传资源库，并联合运用RNA来源的cDNA突变检测法、DHPLC、MLPA以及DNA直接测序法对NF1基因进行突变筛查，以期构建一个快速、准确、经济的突变检测体系，并完成中国汉族人首个大样本的NF1基因突变检测研究以探讨NF1的发病分子机制。

1型神经纤维瘤病 (NF1; OMIM 162200) 是一种常见的常染色体显性遗传性疾病，发病率高达1:2500-3000，主要临床表现为多发性咖啡斑和皮肤纤维瘤，致病基因为NF1基因。NF1基因位于人类染色体17.q11.2，长约280kb，至少包含57个外显子，且因外显子剪切的不同（9br, 23a, 48a）体内有多种转录本的存在。该病发病率高，迄今已逾千种以上的突变位点被报道，但因NF1基因自发突变率高、基因大、结构复杂，且存在多个假基因，因此一度给NF1基因的突变检测带来极大挑战。本研究的目标旨在利用患者的血液标本建立一种敏感、可行、相对经济的NF1基因突变检测体系。基于NF1基因与其假基因序列的差异，设计仅针对NF1基因的特异性引物；因部分产物扩增片段过长，所以还需要额外设计随机的特异性测序引物进行测序；对于外显子36而言，还需要结合巢式PCR技术才能有效实现规避假基因的相关序列。基于以上，我们成功实现了所有NF1基因编码序列的有效、特异扩增。其中，对于部分患者的突变位点还同时进行的DNA和cDNA水平的测序对比和验证。对于在以上基础上都未测得突变位点的患者，再应用MLPA P081/P082和SALSA MLPA P122 NF1 ARE商品化试剂盒(MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands)进行多重连接依赖性探针扩增法以检测是否存在NF1基因内的大片段缺失、全基因缺失或包含NF1基因的染色体部分缺失。基于我们检测结果显示，DNA测序更优于cDNA测序，可以很好地结合多重连接依赖性探针扩增法进行NF1基因突变位点的有效检测。截至目前，在课题组收集的57名NF1患者中，共检测出了53种致病突变位点，突变检测率近93%；其中28种为新突变，其中大部分为移码突变，突变位点分布于整个NF1基因中且无热点突变。基因型-表型关联性分析发现，在中国汉族人中除外大片段基因缺失与疾病严重性相关无其他一致性发现，这点与以往的相关报道相一致。总而言之，通过该课题研究证实，DNA测序结合MLPA是一种敏感、可行和相对经济的突变检测体系，可以有效实现NF1基因的突变位点检测。