可光控免疫毒素的制备及其应用研究

Azobenzene can be reversibly isomerized between the extended trans- and the more compact cis-configuration by illumination with UV or blue-light. Modification with bifunctional azobenzene derivatives usually is intended to change the conformation of the target protein, thereby changing its activity. The sea anemone cytolysin Gigantoxin-4 can induce apoptosis in a broad range of tumor cells. However, it also has obviously side effect toward normal cells. In order to reduce the side effect of Gigantoxin-4, we try to identify the key amino acid residues and structural domains by combination of bioinformatics and experimental tools. Subsequently, combined with the physico-chemical properties of azobenzene derivatives, molecular modification based on rational design was used to achieving the photo-control of Gigantoxin-4 anticancer effects. Furthermore, fusion expression of photocontrollable Gigantoxin-4 and single-chain antibody was used to obtaining the photocontrollable immunotoxin. The anticancer activity of immunotoxin was closed in the process of drug delivery, and activated by illumination when the immunotoxin arrived at tumor location, thus solving the problem of side effect toward normal tissues and organs. The preparation of photocontrollable immunotoxin has great significance for the clinical application of Gigantoxin-4 and the exploration of new treatment for malignant tumors.

偶氮苯衍生物可以通过不同波长的光照在顺式和反式结构间可逆异构化。当偶氮苯衍生物的两端与目的蛋白中的两个半胱氨酸交联后，通过光照改变偶氮苯衍生物的结构，进而改变目的蛋白的结构，实现蛋白活性的开启或关闭。海葵毒素Gigantoxin-4具有较强的抗肿瘤作用，但对正常细胞也有一定的毒副作用。为了减少Gigantoxin-4的副作用，本研究拟通过实验学和生物信息学手段准确定位影响其抗肿瘤活性的关键氨基酸残基和结构域。结合偶氮苯衍生物的性质，通过理性设计，实现Gigantoxin-4活性的光照调控。通过将可光控Gigantoxin-4与单链抗体融合表达，获得可光控免疫毒素，使其在体内运输过程中失活，到达肿瘤部位后再利用光照开启抗肿瘤活性，解决其对正常组织和器官的毒副作用问题。可光控免疫毒素的开发对于降低Gigantoxin-4的细胞毒性，提高其临床应用价值，开辟新的肿瘤治疗方法具有重要意义。

随着抗体技术的逐渐成熟，肿瘤靶向治疗是当前癌症治疗的研究热点，它可以利用肿瘤细胞的特点，如细胞表面的标记物作为靶点来消除癌细胞，从而避免对正常细胞的伤害，更加精准的杀伤肿瘤细胞。与传统放疗和化疗方法相比，免疫毒素对癌细胞具有靶向专一性和高效凋亡毒性，具有广阔应用前景。本课题从免疫毒素的制备及其活性调控出发开展了以下的研究工作：. 通过同源建模以及生物信息学分析确定海葵毒素Gigantoxin-4关键结构域。以一种水溶性的双官能偶氮苯衍生物BSBCA为光敏分子，通过对Gigantoxin-4结构进行分析并结合偶氮苯衍生物的特性，将光敏分子共价偶联在Gigantoxin-4关键结构域附近，利用紫外光和蓝光作为控制条件，通过调节蛋白的构象以光控Gigantoxin-4的活性，筛选出具有最佳光控效果的突变株C127C138。利用MOLDI-TOF、紫外-可见吸收光谱以及热弛豫分析的方法对BSBCA-C127C138进行表征。 . 将RTA分别与可以和肿瘤细胞表面过表达的HER2受体结合的单链抗体4D5 scFv、内质网定位肽KDEL进行融合表达，获得免疫毒素RTA-4D5和RTA-KDEL。进一步将免疫毒素RTA-4D5的C末端与KDEL融合表达，得到具有肿瘤靶向性和内质网定位功能的免疫毒素RTA-4D5-KDEL。. 在翻译起始序列进行密码子同义优化，实现DAB389和DAB389-4D5 scFv在大肠杆菌的高水平的可溶表达。采用(NH4)2SO4处理、疏水层析技术、阴离子交换层析技术和阳离子层析交换技术对DAB389和DAB389-4D5 scFv进行纯化方法优化，通过体外实验检测DAB389-4D5 scFv对肿瘤细胞的靶向结合和诱导凋亡等性质。构建含有光控自我剪接内含肽InN-LOV2-InC的DAB389-4D5 scFv重组表达菌株，探究蓝光照射下InN-LOV2-InC对DAB389-4D5 scFv活性的调控。. 综合上述内容，本研究从免疫毒素的抗肿瘤分子机制和光控元件的调控机制出发，从免疫毒素的制备过程优化、抗肿瘤活性提高和活性调控三个角度入手，研究了免疫毒素产生抗肿瘤作用的分子结构基础和信号传导机制，并以此为依据建立免疫毒素的蛋白质工程改造策略，实现其活性调控。