dsRNA在昆虫体内的剪切模式研究

dsRNA is only digested into effective siRNAs by Dicer enzyme, enter into the subsequent RNAi pathway, and then cause the target gene silencing. However, how many siRNAs were produced after exogenous dsRNA was transfered into insect? Which kinds of siRNAs are more effective? Whether the RNAi efficiency is related with the siRNAs number? To answer these questions, we conducted a preliminary test and discovered that the amount and type of siRNAs digested from dsRNA is closely related its sequence in insect body. So what kind of sequence in insect body is more easily to be cut into effective siRNAs? In order to solve this problem, Asian corn borer will be as the main research object in this project, through small RNA sequencing and bioinformatics analysis, clarify the small RNAs model produced by dsRNA in insect body; through analyze the types and numbers of small RNAs, illustrating the dsRNA digestion rule and sequence preference by Dicer enzyme in insect body; and further through in vivo and in vitro experiments to verify the data analysis results. The results of this program not only can help us to further understand the intrinsic mechanism of dsRNA-induced RNAi effect, but also can guide us to select effective dsRNA fragments to achieve the goal of efficient gene silencing in RNAi research and application.

dsRNA只有被剪切成有效的siRNA，才能进入RNAi通路，引起靶基因沉默。然而，外源dsRNA进入生物体内后被剪切成多少种siRNA？哪种siRNA更有效？RNAi效率与siRNA数量是否相关？为了回答这些问题，我们进行了初步测试，发现dsRNA在昆虫体内被剪切成siRNA的种类和数量与其序列组成密切相关。那么什么样的序列在昆虫体内更容易被剪切成有效的siRNA？为解决这一问题，本项目以亚洲玉米螟为主要研究对象，通过小RNA测序及生物信息学分析，明确进入昆虫体内的dsRNA被剪切成小RNA的情况；通过对小RNA种类和数量的分析，明确dsRNA在体内被剪切的规律及剪切偏好性；通过体内、体外实验验证，确认数据分析结果。本项目的研究结果不仅可以帮助我们认识dsRNA引起RNAi效应的内在机理，而且可以指导我们在RNAi研究和应用中，选取有效片段合成dsRNA，达到高效沉默基因的目的。

RNAi技术作为新型的农业病虫害防控技术，具有绿色、高效、特异性强、简单易用、成本低等优势，被称为农药的第三次革命。近20多年来，科学家开展了大量相关的理论与应用研究，结果表明，昆虫RNAi效率是其能否早日应用于生产的关键问题之一。本项目围绕引起RNAi效应的核心成分dsRNA出发，通过研究其在昆虫体内的剪切模式及降解机制。为RNAi技术的早日应用提供重要的理论基础。通过三年的研究，主要取得以下4项进展。. 1．dsRNA在不同种类昆虫体内具有特异的剪切规律。通过对进入昆虫体内的dsRNA剪切后产生的siRNA进行测序分析，发现dsRNA在不同种类昆虫中具有特定的剪切规律。在鳞翅目昆虫中，dsRNA偏好于在GGU位点进行剪切，而在鞘翅目昆虫中，dsRNA偏好的剪切位点则更加宽泛。 . 2. 鳞翅目昆虫特异存在的核酸酶REase是影响其RNAi效率的主要原因之一。REase基因只存在于部分鳞翅目昆虫中，该基因能够被dsRNA诱导表达，并具有降解dsRNA功能，抑制REase基因的表达，能够提高昆虫RNAi效率。 . 3. 抑制HaREase基因，能够提高昆虫对Bt的敏感性。通过CRISPR/Cas9技术敲除棉铃虫HaREase基因，获得纯合品系。饲喂Bt毒素后发现，HaREase敲除后，棉铃虫对Bt毒素的敏感性显著增强，该结果为RNAi和Bt联合使用进行害虫防治提供新的方案。 . 4. dsRNA在不同种类昆虫中诱导产生的lncRNA分析。以具有不同RNAi效率的棉铃虫、小菜蛾、赤拟谷盗为研究对象，分析dsRNA处理后，发生变化的lncRNA。揭示两者之间存在的关系，为分析不同种类昆虫RNAi效率的差异提供参考。