基因拆分技术限控转基因水稻基因飘流的研究

探索研究用生物学限控措施防止基因飘流的新一代技术，不仅是一项为发展新一代技术的基础研究，而且对进一步促进和推动转基因作物产业化具有重要的现实意义。本研究以水稻为试材，利用Intein介导的蛋白剪接功能，将抗草甘膦基因G2-aroA 拆分成N端和C端两个无功能活性的基因片段，分别与Intein的N端和C端的基因序列结合，形成融合基因EnIn和IcEc。分别构建EnIn和IcEc含叶绿体导肽的核转化载体，用农杆菌介导法导入水稻，通过杂交获得同时含有两个基因片段的转基因植株，研究1）F1杂种草甘膦抗性情况，分析拆分基因的重新组装效率，明确拆分后基因片段在水稻中的遗传规律；2）F1杂种中同时含有两个基因片段的花粉向不育系或常规稻品种的飘流频率，阐明基因拆分技术在转基因水稻上限控基因飘流的效果。建立用生物学限控措施防止基因飘流的技术，为在杂交稻育种上采用转基因技术铺平道路。

探索研究用生物学限控措施防止基因飘流的新一代技术，已成为国际研究的热点和前沿课题，它不仅是一项为发展新一代技术的基础研究，而且对进一步促进和推动转基因作物产业化具有重要的现实意义。本研究将EPSPS基因G2-aroA拆分成N端和C端两部分，分别与intein的N端和C端序列连接，形成融合基因片段EnIn和IcEc，构建了植物表达载体并通过农杆菌介导法转化水稻，获得了不同类型转基因水稻En、Ec和G2。PCR和Southern杂交检测证明目标基因已整合到水稻基因组中且En-33和Ec-5为单拷贝插入。Tail-PCR获得了En-33和Ec-5中外源基因的侧翼序列，确定了En-33和Ec-5中外源基因分别插入到水稻的第11和3号染色体上。经过连续2代筛选，获得了En-33和Ec-5的纯合系。En-33和Ec-5的纯合系进行有性杂交获得转基因水稻杂交种EnEc。草甘膦抗性分析发现，100% 转基因水稻杂交种EnEc以及G2-aroA基因未拆分的转基因水稻具有草甘膦抗性，而单独含有EnIn或IcEc的转基因水稻亲本En-33和Ec-5则不具有草甘膦抗性。RT-PCR分析表明杂交种EnEc中只含有EnIn和IcEc两个基因片段，而不含有完整的G2-aroA基因。金标试纸条在杂交种EnEc能检测到完整的G2-aroA EPSPS蛋白。上述结果证明在水稻中拆分后的G2-aroA基因通过intein介导的蛋白剪接形成了有功能的完整蛋白,在植株水平上的重新组装效率可达到100%。转基因水稻杂交种EnEc与不育系杂交，24.2%的杂交后代具有草甘膦抗性，与两个基因片段位于非同源染色体时25% 杂交后代具有两个基因片段的理论值相符，说明基因拆分后的重新组装效率可达100%，且至少能限控75%的转基因水稻基因飘流，在水稻上建立了基因拆分技术限控转基因飘流的技术平台。后续将继续分析两个基因片段位于同源染色体时限控基因飘流的效果，为基因拆分技术在其他作物上限控转基因飘流的应用提供科学依据。