基于荧光共振能量转移技术的高通量抗生素筛选新方法研究

The object of this proposal is to develop a fluorescence resonance energy transfer (FRET) based optical approach for high-throughput antibiotics screening which employ the signal amplification properties of conjugated polymers. FRET processes and mechanism between conjugated polymers and different fluorescent proteins (green, yellow, red fluorescent protein) will be investigated firstly. With these data in hand, we carry out studies on evaluating antimicrobial susceptibility by measuring FRET ratios with drug-resistant bacteria as a model, and high-throughput screening of antibiotics will be achieved. Utilizing the similar detection principle, drug-resistant tumor cells are chosen as screening model to achieve high-throughput screening of anticancer drugs. It is believed that by monitoring the energy transfer processes of conjugated polymers and fluorescent proteins, studies on their scientific relationship with antibiotics or anti-tumor drugs screening will provide useful data for in-depth studies on the mechanism of drug resistance of bacteria and tumor cells and rapid drug screening.

本项目旨在发展一种基于共轭聚合物与荧光蛋白之间荧光共振能量转移机理的高通量抗生素筛选新方法。在对共轭聚合物与不同颜色荧光蛋白（绿色、黄色、红色荧光蛋白）之间单重、多重荧光共振能量转移过程及机理系统研究基础上，以实验构建的表达不同颜色荧光蛋白的耐药菌为模型，通过分析共轭聚合物与荧光蛋白之间能量转移过程的变化来评价抗生素的敏感性，进而实现对抗生素的高通量筛选。这种筛选方法还可以拓展用于抗肿瘤药物的敏感性分析及高通量筛选。通过开展共轭聚合物与荧光蛋白之间高效能量转移过程与抗生素或抗肿瘤药物敏感性之间的相关性的研究，为深入研究细菌和细胞的耐药机理及快速筛选药物提供实验依据。

细菌与抗生素的博弈催生了越来越多的单药和多药耐药菌。细菌耐药性的出现对人类的健康构成了极大威胁，并已成为一个备受关注的科学问题。相对于研发新的抗生素而言，联合使用多种抗生素会显著提高耐药菌的杀伤能力。本项目利用分子生物学技术成功构建卡那霉素抗性表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌以及氨苄青霉素抗性表达红色荧光蛋白的大肠杆菌。以菌为模型加入抗生素组合，通过判断信号的逻辑输出形式可筛选出有效的抗生素组合。细菌对具有破膜能力的抗生素不易产生耐药性，但目前抗生素筛选方法中，特异性的具有破膜能力的抗生素的筛选方法未见报道。具有破膜作用的抗生素可破坏卡那霉素抗性表达绿色荧光蛋白的大肠杆菌的膜，使得绿色荧光蛋白从菌里泄露出来，利用寡聚芴与绿色荧光蛋白之间的荧光共振能量转移信号可识别出具有破膜能力的抗生素，并可计算其破膜效率，为揭示抗生素作用原理提供了一种新的工具。诺氟沙星的杀菌机理为抑制DNA复制与修复，利用我们构建的荧光共振能量转移的方法发现诺氟沙星也具有一定的破膜作用机理。此外，利用共轭聚合物（PPV）材料与表面结构不同的病原微生物结合能力不同的性质，在不同离子强度缓冲液条件下，实现了对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与真菌的选择性识别、区分和成像。设计并合成了新型功能基团修饰的共轭聚合物材料并探索其生物医药应用。这些结果为深入研究细菌的耐药机理及快速筛选药物提供实验依据，功能基团修饰的共轭聚合物在生物医药领域的应用为相关后续研究工作奠定了基础。