冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统（Cmr-β）多重核酸干涉活性的分子机制

CRISPR-Cas systems provide adaptive immunity against invasive nucleic acids in a small RNA (crRNA)-guided fashion in archaea and bacteria. In the past few years, we have revealed the molecular mechanism of RNA interference and RNA-activated DNA interference activity by a Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas10 system (Cmr-α), and developed the endogenous CRISPR-based genome editing techniques, which have been extensively applied in prokaryotes with active endogenous CRISPR-Cas systems. Notably, we found that the composition and nucleic acid interference activities of a second CRISPR-Cas10 system, Cmr-β, were very different from Cmr-α. In this project, the applicant will analyze the composition of Cmr-β ribonucleoprotein complex, and aims to reveal the regulation and mechanism of multiple nucleic acid interference of Cmr-β system. The results to be obtained in this study will establish a solid foundation for developing CRISPR technology with CRISPR-Cas10 systems.

CRISPR-Cas系统是通过小的向导RNA介导的方式来消灭外源核酸物质从而保护古菌和细菌的获得性免疫系统。近年来，申请人等先后揭示了冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统（Cmr-α）的RNA干涉活性和靶标RNA激活的DNA干涉活性的分子机理，并开发了基于内源CRISPR系统的基因组编辑技术，该技术已在含有活性内源CRISPR-Cas系统的原核生物中广泛应用。特别的是，我们发现冰岛硫化叶菌另一套CRISPR-Cas10系统（Cmr-β）的组成及核酸干涉活性均与Cmr-α系统有着显著区别。在本项目中，申请人将以冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统（Cmr-β）为研究对象，分析Cmr-β核酸蛋白复合体的组分，并解析其多重核酸干涉活性的调控模式和分子机理。该研究将为CRISPR-Cas10系统的应用开发奠定基础。

CRISPR-Cas 系统的机制与应用是近年来生命科学研究领域的热点，是生物资源挖掘和应用的新领域。已有研究表明，III型CRISPR-Cas系统与其它类型有显著不同的核酸干涉活性，是目前报道的生物活性最复杂多样的CRISPR-Cas系统。本项目以冰岛硫化叶菌CRISPR-Cas10系统Cmr-β为研究对象，通过体内共纯化的方法获得了Cmr-β核酸蛋白复合体，解析了复合体的组成以及各亚基的比例，鉴定到其核酸切割模式和活性位点。本项目骨干成员冯明霞与哥本哈根大学Guillermo Montoya教授合作，结合冷冻电镜技术和同源蛋白结构模拟分析，解析了冰岛硫化叶菌中的Cmr-β复合物与不同底物结合后的七种高分辨率结构。结合生化实验数据显示，该III-B CRISPR-Cas系统结合靶标RNA后，其颈环结构的构象变化参与机体避免自身免疫以及响应免疫的机制。成果发表在Molecular Cell期刊上。除了干涉机制之外，III型CRISPR-Cas系统的crRNA加工成熟和靶标核酸的结合机制仍然是不清楚的。本研究鉴定到crRNA的3’端存在一个重要的motif，其与靶标RNA的错配和Cmr1α相应保守氨基酸的突变均会严重影响Cmr-α复合物结合靶标RNA的能力。基于以上结果，我们提出了Cmr1介导Cmr复合物捕获靶标RNA的模型。该成果发表在RNA biology期刊上。此外，项目主持人系统总结了内源CRISPR系统在基因编辑和抗菌工具上的应用，并结合本课题组正在开展的研究工作提出内源CRISPR-Cas系统应用开发策略和研究展望。该成果发表在Frontiers in microbiology期刊上。本研究具有鲜明的创新性，将加深人们对CRISPR-Cas系统核酸干涉机制与多样性的理解，拓宽大家对原核生物免疫系统 的认知，并推动CRISPR-Cas10系统的应用开发。.此外，我们在尝试将CRISPR系统和噬菌体耦联用于防治结核分枝杆菌时，研究发现氨基糖苷抗生素团能够特异性抑制分枝杆菌噬菌体DNA复制。特别值得注意的是，链霉素是治疗结核病的一线药物，因此本研究的发现可能会改变人们先前对两种疗法（噬菌体和抗生素）协同作用的理解，将为人们结合噬菌体和抗生素治疗结核分枝杆菌提供指导。