GTKO/CD46猪-猴异种角膜移植的实验研究

Cornea blind can only be treated by allograft corneal transplantation.Since the serious shortage of donated corneas, many studies use pigs as the source animal for corneal xenotransplantation. Natural antibodies directed against α1,3- galactosyl- transferase(α1,3Gal) epitopes of pig organs are a major factor in xenograft rejection after transplantation into nonhuman primates, and antibodies directed against nonGal antigen is another factor.Production of genetically engineered pigs (_1,3-galactosyltransferase gene-knockout [GTKO] and expressing a human complement-regulatory protein [CD46] pigs) make organ xenotransplantation possible.We set up animal model of wildtype ( WT) pig , GTKO/CD46 pig - rhesus monkey corneal xenotransplantation,then rejection signs, cytokine, IgG、IgM、MΦ、CD4+、CD8+T cell, anti-Gal and membrane attack complex of graft, recipients' aqueous fluid and peripheral blood were evaluated. On this basis, recipients are given immunosuppressor , evaluate the survival of the graft to explore the immunological characteristic of GTKO/CD46 pig -rhesus xenotransplantation, which should provide a theoretical basis for clinical corneal xenotransplantation.

角膜移植是治疗角膜盲的唯一手段，由于角膜供体来源匮乏，异种角膜移植是目前研究的热点。猪角膜是理想的异种角膜移植的材料，野生型猪表达α1,3-半乳糖转基因酶（α1,3Gal），而人或非人灵长类动物表达天然抗体，并且针对非Gal抗原的抗体也是异种器官移植的障碍。α1,3Gal基因敲除、转入人补体调节蛋白CD46(GTKO/CD46)猪的成功培育，为猪角膜异种移植提供了希望。本实验通过建立野生型猪、GTKO/CD46猪-猴异种角膜移植动物模型，观察角膜植片存活情况，检测移植术后猴眼局部及全身的细胞因子含量、IgG、IgM、MΦ、CD4+、CD8+T细胞变化、抗α-Gal抗体、膜攻击复合体的含量等免疫学指标，明确GTKO/CD46猪角膜异种移植术后的免疫学特征。通过免疫抑制剂干预，探讨对GTKO/CD46猪-猴异种角膜移植术后植片长期存活的影响，从而为该基因改造猪角膜临床应用奠定理论基础。

角膜移植是治疗角膜盲的唯一手段，由于角膜供体来源匮乏，猪角膜移植是目前异种角膜移植研究的热点。本研究建立了GTKO/CD46猪-恒河猴异种穿透性角膜移植动物模型和野生型猪-恒河猴异种角膜内皮移植动物模型。并在术后定期观察猪角膜植片的存活情况。对猪角膜植片进行了免疫荧光、免疫组化以及病理学检测。比较了术前及术后恒河猴房水内细胞因子浓度、外周血中T细胞含量以及血浆中α-Gal抗体含量的变化。结果表明：在穿透性角膜移植实验中，GTKO/CD46猪作为供体行猪-猴穿透性角膜移植能延长角膜移植存活时间，但并未达到统计学差异；野生型组角膜植片最长存活时间为157天，而GTKO/CD46组最长存活时间为171天，野生型组2例及GTKO/CD46组4例发生虹膜前粘连，所有野生型组及GTKO/CD46组均发生角膜后膜。组织病理性检测显示野生型组及GTKO/CD46组植片基质均有炎症细胞浸润。野生型组及GTKO/CD46组术后6月房水内IL-6含量较术前显著升高；野生型组猴血浆α-Gal 抗体在术后明显升高，但在GTKO/CD46组无升高。在角膜内皮移植实验组中，5只恒河猴植床在术后30天内重新恢复透明，并且有4只恒河猴的内皮植片在结膜下仅注射倍他米松的条件下存活超过180天（>180天、>180天、>298天和>270天）。免疫组织化学结果揭示大量T细胞（CD4+和CD8+）和巨噬细胞在排斥植片中浸润，B细胞也有少量存在。此外，抗猪特异性抗体（IgG）和补体（C3c）也参与到排斥反应中。但是，T细胞亚群比例和房水中细胞因子浓度（IL-6除外）在植片排斥与未排斥的恒河猴之间却没有显著差异。综合上述结果，GTKO/CD46猪能降低术后受体全身体液免疫反应，但主要参与植片排斥反应的细胞免疫反应并未得到改变，通过供体猪基因改造以降低细胞免疫反应以及寻找降低并发症的方法是未来研究方向。而异种角膜内皮移植是可行和有效的，该技术可以消除植片植床之间的厚度差异，减少相关并发症的发生。更重要的是，猪角膜内皮植片能够在不使用全身免疫制剂的条件下实现长期存活，展现出了光明的临床应用前景。