富硒细菌提高杀菌性抗生素耐受性的机制研究

Deeper understanding of antibiotic-induced physiological responses is critical to developing new “weapons” to kill bacteria. Recently, the damaging reactive oxygen species (ROS) formation induced by bactericidal antibiotics has been proved to involve in numerous metabolic processes in bacteria, including oxidative stress response, extensive oxidative damage to biological macromolecules, cell death and so on..Instead, selenium is generally recognized to be a powerful antioxidant in maintaining the redox balance and defending the oxidative stress, so that protecting the cells from the harmful effects of ROS. Our primary research showed that selenium-rich E.coli could significantly improve the bactericidal antibiotic resistance and reduce their intracellular ROS levels. So this proposal aims at analysising the ROS-regulation mechanism in selenium-enriched E.coli and the mechanisam of selenium-mediated protection in enhancing the tolerance of bacterium to bactericidal antibiotics by means of proteomics and biological molecular techniques, so that we can further clarify the inherent relations between ROS-regulating systems of selenium-enriched E.coli and the enhaned antibiotic tolerance. The study will be benefited to understand the stress response mechanisms against oxidative stress in selenium-enriched bacteria and enrich and improve the bacterium tolerance mechanism. At the same time, which will help us to explore the new strategies to adjust the intracellular ROS level and to develop new drugs targeting with ROS- regulating system.

深刻理解抗生素引起的细菌细胞生理反应对开发新型抗菌药物至关重要。最新研究表明杀菌性抗生素引起的活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）参与了细菌氧化应激反应，大分子损伤乃至细胞死亡的全过程。同时研究发现硒在维持细胞内氧化还原平衡，防止活性氧引起的氧化性损伤中发挥着重要作用。本项目基于申请者前期的研究发现，富硒细菌能够显著提高对杀菌性抗生素的耐受性，降低自身胞内ROS水平，拟利用组学技术和分子生物学技术等方法，解析富硒细菌胞内ROS调控机制，以及这种调控机制的变化与抗生素耐受提高的关系。该研究有利于进一步认识富硒微生物对活性氧胁迫的应激反应机制，丰富和完善细菌对抗生素产生耐药性的作用机制；同时有助于我们探索ROS调节的新方法，研发以ROS调节系统为“药物靶标”的新型药物。

深刻理解抗生素引起的细菌细胞生理反应对开发新型抗菌药物至关重要。最新研究表明杀菌性抗生素引起的活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）参与了细菌氧化应激反应，大分子损伤乃至细胞死亡的全过程，ROS过量同样对动植物细胞也会造成巨大损伤。因此，如何有效防范或降低细胞内ROS剧烈波动是目前研究的一个热点和难题。研究发现硒蛋白在维持细胞内氧化还原平衡，防止ROS引起的氧化性损伤中发挥着重要作用。本研究以模式生物大肠杆菌为对象系统研究了无机硒在微生物胞内代谢情况，高硒培养对细菌生长的影响，富硒菌体细胞内氧化还原关键酶（SOD和catalase）活性以及富硒菌体总抗氧化能力变化，富硒细菌对抗生素引起的氧化胁迫的反应，富硒细菌对抗生素耐受性的变化等科学问题。此方面主要研究内容和结果具体如下：.⑴ 富硒细菌对抗生素引起的氧化胁迫应激响应分析表明富硒细菌在接触高致死剂量的杀菌性抗生素时细菌的敏感性显著变化，富硒菌体对抗生素的耐受力明显提高；同时富硒细菌与无硒菌体相比菌体细胞的总抗氧化能力明显提高，并且菌体细胞的总抗氧化水平与细胞内总硒含量成正相关关系。.⑵ 富硒培养对菌体SOD酶和过氧化氢酶活力的影响研究发现：经过硒处理的细菌其菌体总SOD活性水平要高于未经硒培养的野生型菌体。并且细菌在不同的培养时段其不同SOD酶活表达有一定差异。整体上富硒菌体的过氧化氢酶活力要高于无硒菌体。.⑶ 富硒培养对大肠杆菌生长的影响及耐高硒菌株的筛选获得了富硒优势菌株E.coli C5。该菌株能在高硒痕硫环境下连续传代培养且相比其它野生型菌株（E.coli ATCC25922，E.coli 23）在同样高硒痕硫环境下有生长优势，经适应性驯化后的细菌在高硒环境下依然能保持细胞完整性和一定的繁殖力。.⑷ 利用基因工程的技术构建了hMn-SOD-pET28a重组表达质粒，并在E.coli BL21(DE3)中进行SOD表达，对富硒h Mn-SOD的制备进行初步研究，富硒SOD硒含量比不含硒SOD活性相对提高了41%左右，其比活可以达到3844U/mg。