LncRNA XLOC_130087在猪诱导多能干细胞重编程过程中的调控机制

Pluripotent stem cells play an important role in human disease modle, developmental modle and organ transplantation researches. Long non-coding RNA(LncRNAs) were found to participate in multiple biology progress, such as development, differentiation, pluripotency, disease and so on. However, there are few researches on the function of LncRNA in pig iPSCs. We have previously established two types （mouse and human ESC-like） of porcine iPSCs and analyzed the transcriptome of them by deep sequencing. Bioinformatics analysis showed that LncRNA XLOC_130087 is expressed specifically in porcine iPSCs, which was morphologically similar to mouse ESCs. This implied that LncRNA XLOC_130087 perhaps involved in reprogramming of porcine iPSCs. Combined with modern molecular biology and bioinformatics analysis, We will investigate the transcription and regulation mechanisms of LncRNA XLOC_130087 in the process of porcine iPSCs reprogramming, expecting to enrich the regulation network of pig iPSCs reprogramming and provide theoretical basis for establishing naïve pluripotent cells in pig.

多能干细胞在人类疾病模型制备、发育模式研究、器官移植等方面扮演着重要角色。长非编码RNA（LncRNAs）可以参与个体发育、分化以及多能干细胞（iPSCs）调控等多种生物学过程。然而，目前LncRNAs在猪iPSCs上的研究极少。本课题组前期诱导获得了具有两种形态即小鼠和人胚胎干细胞（ESCs）的猪iPSCs细胞系，并对其进行了转录组测序，找到了在形态上类似于小鼠ESCs的iPSCs中特异表达的LncRNA XLOC_130087，表明其可能参与了猪iPSCs的重编程过程。本项目拟以猪LncRNA XLOC_130087为研究对象，结合现代分子生物学和生物信息学分析方法，进一步研究其在猪iPSCs中的转录调控机制及在猪iPSCs重编程过程中的调控机制，期望能够丰富猪iPSCs重编程过程中的调控网络，为获得猪初始态（naïve）多能干细胞奠定基础。

长非编码RNA在多能干细胞形成以及胚胎发育过程中具有重要的调控作用，但详细机制还不清楚。本实验通过对猪胎儿成纤维 (PEF) 细胞、猪诱导多能干细胞 (piPSCs) 和猪不同时期早期胚胎的转录组数据进行生物信息学分析, 获得了可能与合子激活相关的关键的特异lncRNAs： XLOC-040580和XLOC-164268。并通过lncRNAs与编码基因之间的共表达调控网络, 获得了可能与lncRNAs 相互作用的编码基因。利用qRT-PCR检测了XLOC-040580和XLOC-164268在猪早期胚胎不同发育阶段的表达水平, 证实了其在猪合子激活过程中的特异高表达。在piPSCs上敲降这两个lncRNAs, 检测其预测靶基因的表达水平。结果表明, 部分预测靶基因的表达水平发生了显著的变化。在猪孤雌胚胎1-细胞时期注射相应的siRNAs敲降lncRNAs, 检测lncRNAs对胚胎发育的影响。结果表明, XLOC-040580和XLOC-164268在猪早期胚胎合子激活过程中发挥着重要作用。采用单细胞微流控芯片转录组分析技术对单个细胞进行检测，我们在480个来自猪胚胎植入前的单个细胞中同时检测了96个已知在胚胎早期发育和干细胞多能维持中发挥作用的基因的mRNA水平。发育的转换过程可以根据不同的基因表达区分，分别鉴定了发育早期和晚期表达的成对PAX6和AQP3。其二者可以分离在猪早期和晚期胚泡特定的基因表达，如DAB2、PDGFRA、Nanog、FN1、HNF4A、GSC、NR5A2和KAT6A。在富含脂质和脂肪酸的培养条件下，生成了类似小鼠胚胎干细胞(ESCs)的猪iPSCs。这些猪的iPSCs对ESCs多能标记物呈阳性，具有对所有三种胚层的分化能力，重要的是具有聚集成猪囊胚内细胞团(ICM)的能力。通过对PSC分泌蛋白的分析，发现Activin A在促进滋养外胚层（TE）分化的同时阻碍了外胚层（EPI）谱系的发育，导致受体胚胎EPI谱系被PSC所取代。PSCs影响小鼠早期胚胎的发育，通过分泌Activin A提高受体胚胎的EPI能力。研究结果将为未来大家畜干细胞育种体系的建立提供技术支持和理论依据。