基于Nrf2-MRP通路探讨甘草对胆汁淤积型肝损伤的保护作用机制

Traditional Chinese medicine licorice has the detoxifying and hepatoprotective properties, and some herbs with hepatotoxicity are often used in combination with licorice. Cholestatic liver injury is a common type of herb-induced liver injury. Studies show that licorice can improve the cholestatic liver injury, but the mechanism remains unclear. The accumulation of bile acids in the liver is the main cause of cholestatic liver injury. MRP2, MRP3 and MRP4 are the bile acids efflux transporters, which play an important role in the secretion and excretion of bile. Our preliminary studies confirm licorice can significantly induce the expression of MRP2 via activation of Nrf2, therefore we speculate licorice may induce the expression of MRP2, MRP3, MRP4 by interfering Nrf2 signal pathway, promoting the removal of toxic bile acids from liver, so as to alleviate cholestatic liver injury. We adopt the classical cholestasis animal model, combining the technique of molecular biology，gene knockout, and quantitative analysis of bile acid, to explore the mechanism of how licorice prevents cholestatic liver injury metabolism, which provides the basis for the safe use of Chinese medicine.

传统中药甘草具有解毒和保肝作用，一些具有肝毒性的中药常与甘草配伍应用。胆汁淤积型肝损伤是中药药源性肝损伤的常见类型，研究表明甘草具有改善胆汁淤积型肝损伤的作用，但机制尚不明确。毒性胆汁酸在肝内聚集是造成胆汁淤积型肝损伤的主要原因。MRP2、MRP3、MRP4属于胆汁酸外排转运蛋白，在胆汁的分泌和排泄过程中起着重要作用。本课题组前期研究发现甘草可通过激活Nrf2调控MRP2表达，因此推测甘草可能通过Nrf2诱导胆汁酸外排转运体MRP2、MRP3、MRP4的表达，促进毒性胆汁酸从肝内清除，从而缓解胆汁淤积造成的肝损伤。本研究采用经典胆汁淤积动物模型，结合分子生物学和基因敲除技术，与胆汁酸代谢定量分析相对接，探讨甘草防治胆汁淤积型肝损伤的作用机制，为中药安全用药提供依据。

甘草中具有代表性的主要活性成分是三萜皂苷和黄酮类化合物。甘草酸是三萜皂苷中含量最高的一种，经胃肠代谢后转化为甘草次酸(GA),甘草苷(LQ)是甘草类黄酮中重要的单体活性成分。另外，前期研究采用ARE报告基因法对四种甘草的主要成分，分别是甘草次酸、甘草苷、甘草素以及异甘草素进行筛选，发现异甘草素（ISL）的诱导作用最明显。因此，我们选取了甘草次酸、甘草苷和异甘草素进行实验，确证了甘草对于胆汁淤积型肝损伤的保护作用并探索其作用机制。研究发现，三种单体均可逆转ANIT导致的ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA等血清生化指标的升高，组织学检验发现GA和LQ均可明显改善肝细胞的损伤状态。进一步探索机制发现：GA可激活Sirt1、FXR及其下游胆汁酸转运蛋白NTCP、BSEP和MRP2,以及Nrf2及其下游转运蛋白MRP3、MRP4，促进胆汁外排；可显著抑制NF-κB炎症通路的激活和TNF-α浓度的升高，抑制炎症反应；同时可下调Bax /Bcl-2、caspase 3和caspase 9的表达，抑制肝细胞凋亡。LQ可逆转ANIT导致的肝脏组织中Sirt1和FXR的表达降低，并进一步上调Nrf2的核表达，诱导胆汁酸转运蛋白BSEP、NTCP、MRP3和MRP4的表达。提示甘草通过激活Sirt1/FXR/Nrf2，进而调控其下游的胆汁酸转运蛋白的表达，维持体内胆汁酸稳态平衡，是甘草防治胆汁淤积型肝损伤的重要机制之一。另外，我们进一步开展了miRNA测序，以期寻找胆汁淤积性肝损伤的生物标志物。结果提示，参与调控代谢的基因和miRNA是LQ防治胆汁淤积型肝损伤的关键靶点，差异表达的miR-34a, miR-155, miR-221和miR-125,已有文献报道是Sirt1的上游调控因子，后续将进一步确证其调控关系。.过去对药物肝毒性的研究主要关注药物对肝细胞的直接损伤，忽略了胆汁淤积这一导致肝损伤的重要因素。甘草保肝的作用已得到临床验证，然而对其护肝机制的研究主要集中在抗炎和抗氧化方面。本次课题从缓解胆汁淤积的角度探讨甘草的护肝机制，对丰富甘草临床应用具有重要意义。