拟南芥抗病相关的植保素Camalexin中的噻唑环合成机理研究

植保素（Phytoalexin）是植物受到病原菌刺激后产生的一类具抗菌活性的低分子量次生代谢物，对植物抗病原菌的侵染有重要作用。Camalexin是拟南芥中主要的植保素，其分子仅包括一个吲哚环和一个噻唑环。文献证明，作为吲哚环最初供体的色氨酸经几步已知的催化反应形成IAN。此后，合成噻唑环所需的最初供体Cys-R (Cys为半胱氨酸，R为未知基团)连接到IAN，Cys-R(IAN)在未知酶的催化下除去"R"基团,形成的Cys(IAN)在CYP71A15催化下合成Camalexin。但Cys-R是什么、催化Cys-R与IAN连接及除去Cys-R(IAN)中"R"的步骤及酶是什么，目前并不清楚。我们用抑制剂和化合物饲喂的研究发现，Cys-R是GSH。本项目拟利用生化及遗传学方法，确定催化GSH与IAN连接、除去GSH-IAN中的Glu和Gly的酶，以期阐明Camalexin中噻唑环合成的机理

拟南芥的植保素Camalexin(简称CA)分子由一个吲哚环和一个噻唑环组成。吲哚环已知来源于色氨酸，之后合成吲哚乙腈(IAN)。合成噻唑环所需的初始供体Cys-R (R：未知基团)在未知酶的催化下连接到IAN；Cys-R(IAN)在未知酶的催化下去除R基团，形成Cys(IAN)；而后在PAD3催化Cys(IAN)上的Cys形成噻唑环，最终产生CA。但Cys-R 是什么、催化Cys-R 与IAN 连接及去除Cys-R(IAN)中-R的步骤及酶是什么并不清楚，这就是本项目的主要研究内容。本项目完成了主要研究内容。研究结果表明：(1) 利用GSH合成抑制剂或GSH合成缺陷突变体(pad2)抑制GSH合成，显著降低病原菌和MKK9DD表达诱导的CA合成量，饲喂GSH可明显恢复pad2和MKK9DD/pad2植株CA合成缺陷表型; 鉴定出 CA合成的中间产物GSH(IAN)，饲喂GSH(IAN)可恢复pad2和MKK9DD/pad2植株CA合成缺陷表型。证明GSH是CA噻唑环合成的初始供体Cys-R，GSH通过形成GSH(IAN)而参与CA合成过程。(2)利用蛋白组学和GST活性分析，发现GST参与病原菌和MKK9DD表达诱导的CA合成；利用在酵母表达GSTs、在拟南芥WT和MKK9DD背景下过表达或敲除GST分析，发现GSTF6催化GSH(IAN)形成，参与病原菌和MKK9DD表达诱导的CA合成。证明GSTF6是在CA合成过程中催化GSH与IAN连接反应的酶。(3) 利用GGT活性抑制剂可显著抑制病原菌和MKK9DD表达诱导的CA合成；GGTs的突变体(ggt1和ggt2)和PCS1的突变体(pcs1)中病原菌诱导的CA合成显著减少；鉴定到了CA 合成的中间产物(IAN)CysGly和GluCys(IAN)，饲喂(IAN)CysGly和GluCys(IAN)均可以恢复pad2和MKK9DD/pad2植株CA的合成；证明在GSH(IAN)进一步产生CA的过程中催化切除Glu需要GGT1/2、切除Gly需要PCS1。(4) 在病原菌和MKK9DD表达诱导的CA合成过程中，与吲哚环和噻唑环合成相关的基因转录均显著上调，证明CA合成需要整个合成途径相关基因协同激活。由此，本项目发现了CA噻唑环的初始供体、噻唑环合成的新反应步骤和催化酶，揭示了CA噻唑环合成的分子机理。