氧化修饰对人朊病毒蛋白突变体E200K错误折叠的影响

Conversion of α-helix rich cellular prion protein (PrPC) into β-sheet rich pathogenic scrapie-associated prion protein (PrPSc) is believed to be the key procedure in prion diseases. Mutations in prion protein are thought to be the cause of inherited prion diseases. Prion protein mutant E200K has been associated with the inherited familial CJD. However, the mechanism of its pathogenesis is still not clear. We have found that the cell-like crowded environment could accelerate the misfolding of prion protein in our previous studies (Zhou Z., et al. J Biol Chem. 2009 & Zhou Z., et al. Biophys J. 2011). On the basis of these works, this project aims to study the effects of methionine oxidative modification on misfolding of prion protein mutant E200K. Methionine is one of the most oxidation-prone amino acid residues, human PrP E200K has been found spontaneously oxidized in humans suffering from familial CJD. Most of the methionine residues in brain PrPSc are oxidized into methionine sulfoxides. However, there are few studies examining the relationship between oxidative modification of PrP E200K and its structural conversion. In this project, we will focus on comparing the differences of thermal stability and secondary structure between oxidized and non-oxidized PrP E200K by differential scanning calorimetry (DSC) and circular dichroism spectrum (CD). Meanwhile, the misfolding dynamics will be investigated by ThT fluorescence and UV turbidity, and the proteinase K resistance will be studied among oxidized, non-oxidized PrP E200K and their misfolding products. Furthermore, we try to directly detect the oxidation and aggregation states of PrP E200K expressed in neuronal cells under oxidative stress. These studies may provide experimental evidences to understand the biochemical basis of E200K causing familial CJD, and may provide new clues for prevention and treatment of prion diseases and other neuro-degenerative diseases.

人朊病毒蛋白E200K突变与家族遗传性人克雅氏症（CJD）密切关联，其致病机理目前仍不明了。我们以往的工作发现拥挤环境能够促进人朊病毒蛋白的错误折叠动力学进程，可能对朊病毒感染及复制有重要意义（Zhou Z., et al. J Biol Chem. 2009 & Zhou Z., et al. Biophys J. 2011）。本项目着眼于甲硫氨酸残基（Met）氧化修饰对人朊病毒蛋白突变体E200K错误折叠的影响这一新视角，试图结合生物物理及生物化学方法研究氧化修饰导致E200K二级结构、热力学稳定性的改变，检测氧化修饰前后E200K错误折叠动力学及蛋白酶K消化抗性等关键表征的差异。进而从细胞水平研究E200K在细胞氧化应激状态下的氧化修饰及错误折叠状态。期望为阐明人朊病毒蛋白E200K突变导致家族遗传性CJD的致病机制提供重要依据，并为朊病毒病及相关神经退行性疾病的防治提供新的线索。

朊病毒病是一组由朊病毒蛋白构象变化导致的神经退行性疾病。家族遗传性朊病毒病包括人克雅氏症(CJD)、家族致死性失眠症(FFI)及GSS综合症(GSS)，目前已发现三十多种朊病毒蛋白基因突变与遗传性朊病毒病的发生相关。E200K突变是世界范围内最为常见的朊病毒蛋白基因突变，与家族遗传性CJD密切关联，其致病机理目前仍不明了。朊病毒病的一个重要病理表现即神经细胞的氧化损伤。本项目着眼于研究甲硫氨酸残基(Met)氧化修饰对人朊病毒蛋白突变体E200K 错误折叠的影响。研究结果表明，位于人朊病毒蛋白突变体E200K结构表面的Met109/112/129/134/154/166的氧化能够显著降低其热力学稳定性，但对其结构的影响并不显著。而Met213的氧化则导致E200K结构的松散,进而使得掩埋在内部的Met205/206更易发生氧化。Met213/205/206的氧化则导致E200K内部疏水核心的暴露及构象的进一步变化，诱导E200K在低pH环境形成多聚体形式，并在一定程度上增强其抗蛋白酶K消化的能力。细胞水平的研究表明，位于人朊病毒蛋白突变体E200K 结构表面Mets的氧化不会对其细胞定位及聚集状态产生显著影响，而Met213/205/206的氧化则能够导致E200K滞留于细胞质并形成点状聚集。本项目的研究成果为阐明氧化损伤在人朊病毒蛋白E200K 突变相关家族遗传性CJD 中的作用提供重要实验依据，并为朊病毒病及相关神经退行性疾病的防治提供新的线索。此外，本项目亦探讨了甲硫氨酸残基氧化对家族致死性失眠症相关的D178N突变体错误折叠的影响。我们发现D178N突变体对氧化最为敏感，在相对较短的时间内所有Mets能够被完全氧化，而野生型朊病毒蛋白内部Met205/206的氧化相对较难，E200K突变体则介于两者之间。甲硫氨酸残基的氧化诱导D178N形成富含β-折叠结构且具有细胞毒性的寡聚体，同时其抗蛋白酶K酶解的能力相对更强。在细胞水平，氧化诱导D178N在神经细胞N2a中形成更加显著的聚集并增强其细胞毒性。这些工作为理解氧化损伤在D178N相关家族致死性失眠症病理进程中的作用提供了重要实验参考。上述研究结果已发表于Biochim Biophys Acta 1842 (12) 2345–2356及Biochim Biophys Acta 1864 (4) 346-358。