水生甲壳动物新型病原微生物-螺原体非编码RNA的鉴定与分析

水生甲壳类动物新型病原微生物-螺原体是本课题组在江苏省和前期国家自然基金项目资助下发现和分离出的虾蟹重大流行病致病菌。利用这一首次发现的水生动物螺原体微生物资源，在本课题组已完成的该螺原体全基因组测序、功能注释和部分功能基因研究的基础上，采用第2 代测序技术结合生物信息学方法，从整个基因组和转录组水平，对该病原菌的非编码RNA(small noncoding RNA，sRNA)进行全面筛查；运用Northern杂交技术实施实验鉴定；利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析该病原菌sRNA在不同宿主体内、不同感染时期和体外培养不同阶段的转录调控差异。初步确定该螺原体特定sRNA的生物学功能，为进一步探讨该病原菌的致病分子机理奠定基础。本项目的实施不但可以深化水生螺原体的基础研究，而且还可推动螺原体类微生物的基础生物学研究进程，最终有助于形成这种新型病原微生物的系统研究体系和创新成果。

本研究利用转录组测序和基因数字表达谱等技术，结合生物信息学、比较组学和文献组学等多种方法，分别对水生甲壳动物新型病原螺原体的非编码RNA(ncRNA)进行了系统的筛选与鉴定分析。主要研究成果如下：(1) 在基因组水平上，通过使用比较基因组、转录单元和机器语言相结合的方法，利用多种ncRNA预测软件，首次系统地对水生螺原体细菌进行了综合预测，得到ncRNA基因共42个；在转录组水平上，通过对螺原体进行非编码RNA测序分析，得到ncRNA基因共21个，整合两种水平的研究结果，共获得ncRNA基因共54个。(2) 利用基因数字表达谱(RNA-seq)技术，分析了这些ncRNA基因在螺原体感染时期（入侵初期和发病期），不同生长时相（对数期和非对数期）的表达差异，就非对数期相对于对数期而言，共检测到ncRNA基因41个，差异显著28个，显著上调11个，下调17个；发病期相对于入侵初期，共检测到ncRNA基因19个，差异显著11个，显著下调7个，上调4个。(3) 对非编RNA的靶基因进行预测，54个ncRNA共获得靶基因761个，其中通过利用毒力因子数据库的比较分析，结果显示，有30个靶基因可作为潜在的毒力因子。(4) 与此同时，利用基因数字表达谱技术对螺原体编码基因差异表达分析可知，在该菌1242个基因中，不同感染时期，共有192个显著表达，就发病期相对于入侵期而言，显著上调108个，显著下调84个；不同生长时相，共有643个显著表达，就非对数期对对数期，显著上调287个，显著下调356个。上述结果，可为ncRNA与靶基因间相互作用的分子机理研究，提供有力依据和基本保障。