1,25二羟维生素D3调控miR-155提高猪肠上皮细胞抗轮状病毒作用及机制研究

Innate immunity is the first line of defense against invading pathogens. RIG-I/IPS-1 signaling pathway plays a key role in the early antiviral response to rotavirus. Recent studies have shown nutrients could affect the antiviral innate immune response, but the mechanism is not clearly demonstrated. The objective of this study is to establish porcine rotavirus infected IPEC-J2 model to explore whether 1,25D3 could confer protection against rotavirus. Immunohistochemistry, western blot, dual-luciferase report assay, gene overexpression and gene silencing technologies were employed to determine whether 1,25D3 mediate RIG-I/IPS-1 signaling pathway by miR-155 targeting TBK1. The present project is of important not only to further reveal the mechanisms of 1,25D3 to improve the intestinal epithelial cells against rotavirus, but also to lay an important theoretical foundation for the application of nutritional regulation of animal antiviral ability.

先天性免疫系统是机体抵御病原菌入侵的第一道防线。RIG-I/IPS-1信号通路在机体轮状病毒感染早期的抗病毒天然免疫应答中具有重要作用，近年来研究表明，营养素可以影响抗病毒天然免疫应答过程，但作用机制尚不清楚。本项目以猪轮状病毒感染的IPEC-J2细胞为模型，通过外源添加1,25D3处理，考察其提高猪肠上皮细胞抗轮状病毒的作用；利用免疫组化、免疫印迹技术、双荧光素酶报告实验、基因过表达和沉默技术证实1,25D3调控miR-155作用于TBK1，介导了RIG-I/IPS-1信号通路。本项目的研究将有助于揭示1,25D3提高猪肠上皮细胞抗轮状病毒作用的分子机制，为应用营养调控动物抗病毒能力奠定重要理论基础。

维生素D在先天性抗病毒方面具有重要作用。但是，维生素D抗轮状病毒作用及其机制还不清楚。本研究的目的是探讨1,25D3的抗轮状病毒作用是否是调控miR-155作用于TBK1/IRF3信号通路。本研究以猪轮状病毒感染的IPEC-J2细胞为模型，利用双荧光素酶报告实验、基因过表达和干扰技术考察1,25D3提高猪肠上皮细胞抗轮状病毒的作用机制。试验结果表明：1,25D3显著降低轮状病毒mRNA表达和轮状病毒抗原浓度（P< 0.05），显著增加TBK1 mRNA和蛋白水平（P< 0.05），以及IRF3的磷酸化水平（P< 0.05）。轮状病毒感染显著上调了miR-155-5p的表达（P< 0.05），1,25D3显著降低轮状病毒诱导的miR-155-5p表达的上调（P< 0.05）。过表达miR-155-5p mimic显著降低TBK1和pIRF3蛋白水平、pIRF3/IRF3蛋白比值、IFN-β mRNA水平（P< 0.05），显著上调轮状病毒 mRNA水平（P< 0.05）；而抑制miR-155-5p表达显著上调TBK1和pIRF3蛋白水平、pIRF3/IRF3蛋白比值、IFN-β mRNA水平（P< 0.05），显著降低轮状病毒 mRNA水平。双荧光素酶报告基因系统实验结果显示：TBK1-3’UTR野生型重组质粒分别与mimic control、miR-155-5p mimic共转染，miR-155-5p mimic处理组的荧光素酶活性显著低于mimic control对照组（P < 0.05）；psiCHECK-2空载分别与mimic control、miR-155-5p mimic共转染和TBK1-3’UTR突变型重组质粒分别与mimic control、miR-155-5p mimic共转染共转染，荧光素酶活性都无显著差异（P > 0.05）。综上所述，1,25D3可通过负调控miR-155-5p表达，促进TBK1-IRF3信号通路的活化，促进IFN-β的转录表达，最终抑制RV复制增殖。本项目的研究将有助于揭示1,25D3提高猪肠上皮细胞抗轮状病毒作用的分子机制，为应用营养调控动物抗病毒能力奠定重要理论基础。