碳酸酐酶在脊尾白虾适应盐碱胁迫中的作用及其分子机制

Large areas of saline-alkaline water are distributed widely throughout the world. In China, saline-alkaline water covers approximately 45.87 million hectares. Due to poor buffering capacity, an unstable proportion of major ions, high pH values and high carbonate alkalinity concentrations, most saline-alkaline regions still remain unexploited. The ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda is one of the most important commercial shrimps, which tolerates a wide range of salinity, pH and carbonate alkalinity. All of the traits makes it an ideal experimental material to research the mechanism of salinity-alkalinity adaption in crustacean. Carbonic anhydrase catalyzes the interconversion of CO2 and HCO3−, and plays important role in keeping balance of body acid base and regulating the pH of body fluid. In this study, the effects of salinity and alkalinity, two of the most important stress factors for determining the patterns of gene expression and subcellular localization of two carbonic anhydrase genes in different development stage, were investigated. RNA interference, over expression and co-IP techniques were used to study the interaction of molecular network between two carbonic anhydrase genes and the major ion transport enzymes. The results provide a basic understanding of the physiological regulation during salinity-alkalinity adaptation.

盐碱水域是一种世界性的低产水资源，仅中国就有4587万hm2盐碱水域，由于具有高盐度、高碱度、高pH以及复杂离子组成等特点，一般常规的水产动物无法在其中生存繁殖，使得该类水资源尚未被有效开发利用。脊尾白虾对环境适应性广，对盐度、pH及碳酸盐碱度均具有较强的耐受性。深入理解脊尾白虾适应盐碱胁迫机制有助于开发选育更多耐盐碱养殖品种。碳酸酐酶是参与渗透压调节、离子交换及维持酸碱平衡等生理生化过程的核心酶之一，本项目结合目前滨海地区盐碱水域养殖现状，以脊尾白虾为研究对象，分析不同发育时期脊尾白虾两种碳酸酐酶基因在盐碱混合胁迫下的响应特征，并利用RNA干扰、过表达和免疫共沉淀技术进一步研究其在脊尾白虾耐受盐碱胁迫中的重要作用及其与主要离子转运酶间相互作用分子网络关系，揭示碳酸酐酶基因在脊尾白虾适应盐碱胁迫中的转录调控机制。本结果将为研究甲壳动物耐盐碱机制提供理论依据，对利用盐碱水资源具有重要意义。

我国有大量盐碱水域因具有高盐度、高碱度、高pH以及复杂离子组成等特点，一般常规的水产动物无法正常生存繁殖，严重阻碍了该类水资源的开发利用。碳酸酐酶是参与渗透压调节、离子交换及维持酸碱平衡等生理生化过程的核心酶之一，可能在水产动物响应盐碱胁迫中发挥重要作用。在本课题的资助下我们深入开展了碳酸酐酶在脊尾白虾适应盐碱胁迫中的作用及其分子机制研究：克隆获得三个脊尾白虾碳酸酐酶基因cDNA全长序列，分别命名为EcCAc、EcCAg和EcCAb，序列分析显示EcCAc和EcCAg属于α-碳酸酐酶家族，EcCAb属于β-碳酸酐酶家族。EcCAc和EcCAg在鳃组织中表达量最高，EcCAb主要分布于肌肉组织。EcCAc在蚤状幼体和仔虾期表达量较高，EcCAg在蚤状幼体后期表达量较高，EcCAb在成虾时期表达量略高。盐碱胁迫显著影响了EcCAc和EcCAg基因的表达模式，低盐环境下(盐度5)，中、高浓度碳酸盐碱度(S5C5和S5C10组)均可诱导EcCAc和EcCAg mRNA显著上调表达(P<0.05)，且均在胁迫3天后表达量最高；正常盐度下(盐度30)，EcCAc和EcCAg在中、高浓度碳酸盐碱度(S30C5和S30C10组)胁迫前期呈现一定程度显著上调表达(P<0.05)，胁迫7天后，EcCAc表达基本恢复至正常水平，而EcCAg相较对照组呈一定程度的下调表达。EcCAb在盐碱胁迫中的表达没有明显规律性及较大程度的变化。荧光免疫组化发现对照组EcCAc在鳃小片基部和上皮细胞均有分布，而EcCAg只在鳃小片中部的上皮细胞分布，鳃小片末端及基部未检测到阳性信号；碱胁迫后EcCAc和EcCAg均特异性分布在鳃小片上皮细胞和柱细胞中。干扰EcCAc或EcCAg基因表达后，脊尾白虾盐碱胁迫下48h的存活率显著降低(P<0.05)，而干扰EcCAb基因表达后，存活率与对照组无显著差异(P>0.05)。通过检测干扰和过表达EcCAc或EcCAg基因表达后检测其对脊尾白虾体内其他重要离子转运基因表达的影响，发现EcCAc可直接调控EcNHE基因表达，EcCAg可直接调控EcNHE和EcNBC基因表达。本结果为研究甲壳动物耐盐碱机制提供了理论依据，对利用盐碱水资源具有重要意义。