一个具有转座活性的逆转座子诱导苹果短枝变异的分子机理

为促进苹果功能基因组学研究，揭示具有转座活性逆转座子转座诱变条件及其诱导苹果短枝变异机理，本项目将在前期研究基础上，以诱导"元帅"发生短枝突变的Ty1-copia类逆转座子atr1、"元帅"及由atr1转座所致的四个短枝变异品种"华帅1号"、"玫瑰红"、"奥勒冈矮生"和"矮红"为对象：分离逆转座子atr1全长；根据已获得的atr1-LTRs中调控元件设置系列胁迫条件诱导atr1活性表达，荧光定量PCR分析不同处理样品中atr1活性表达情况；IRAP结合测序技术检测转录激活样品中逆转座子atr1转座结果，明确逆转座子atr1转座条件；利用逆转座子atr1分离其在四个短枝变异品种基因组内引起插入突变的基因，RNAi技术结合分子和田间检测验证各基因功能，阐明逆转座子atr1诱导苹果短枝变异机理。本研究将为利用逆转座子atr1创造变异，培育新的芽变品种及苹果基因功能鉴定等功能基因组学研究奠定基础。

为揭示具有表达活性的逆转座子活性表达条件及其诱导苹果短枝变异的分子机理，本项目利用IRAP技术对苹果元帅系和富士系芽变品种进行了鉴定，结果表明逆转座子在苹果基因组内的插入具有随意性，转座插入和逆转座子间重组可能是引起苹果无性系变异的两个重要机制。利用IPCR（Inverse PCR）等方法获得了具有表达活性的逆转座子atr1全长，其长度为4996bp，两端为388bp的LTRs，包含了末端倒转重复结构5’-TG...CA-3’；PBS紧随5’-LTR之后；PPT即位于3’-LTR的上游；atr1编码区含有GAG、PR、INT、RT和RH区域，为典型的Ty1-copia类逆转座子。利用荧光定量PCR方法检测了胁迫处理后不同时间及不同胁迫处理条件下atr1的表达活性，结果表明2,4-D、ABA、SA和伤害均能不同程度地提高atr1表达活性，其中ABA诱导强度 >伤害、2,4-D > SA；胁迫处理后atr1转录活性呈现先高后低的趋势，处理后9h活性表达达到高峰。在IRAP获得的“元帅”四个短枝变异品种“华帅1号”、“玫瑰红”、“奥勒冈矮生”和“矮红”特异性扩增片段基础上，利用TAIL-PCR等方法在上述四个短枝变异品种中分别获得了一约3066bp左右的特异性扩增条带，比对分析发现四个短枝变异品种的特异性扩增条带相似性极高，说明四个元帅系短枝变异品种短枝突变机理可能一致。将3066bp提交苹果基因组网站比对显示前875bp和后2191bp位于染色体不同位置，且二者在苹果染色体中均有多个位点，这暗示苹果短枝变异可能是逆转座子atr1所介导的染色体重组结果。