Dnmt3a和Dnmt3b对急性髓系白血病干细胞的调控机制研究

Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by the presence of clonal population of hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) with impaired differentiation. Although AML has been traditionally considered to result from genetic alterations, increasing experimental evidence has demonstrated that epigenetic modifications play a significant role in the development and maintenance of leukemia cells. The de novo methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are responsible for the generation of genomic methylation patterns. While DNMT3A is frequently mutated in hematologic malignancies, DNMT3B is rarely mutated. In our previous study, we demonstrated that deletion of Dnmt3b accelerated the progression of MLL-AF9 leukemia by increasing leukemia stem cells (LSC) and enhancing cell cycle progression. Furthermore, loss of Dnmt3b was able to synergize with Dnmt3a deficiency in leukemia development, which showed further increased LSC frequency. Taken together, these results demonstrate that Dnmt3b plays a tumor suppressor role in MLL-AF9-induced AML progression. However, how Dnmt3a in coordination with Dnmt3b to promote LSC proliferation is still unknown. In our current study, we will investigate the synergistic effect of Dnmt3b and Dnmt3a in LSC proliferation by applying flow cytometry, microarray, RRBS, CRISPR/Cas9 and so on. And we are going to further verify the key target genes of DNMT3A/DNMT3B in AML patients’ cells，thereby providing new molecular targets for future development of clinical therapy.

急性髓系白血病（AML）是一种异质性的恶性造血疾病，DNA甲基化修饰作为表观遗传学最重要的调控方式之一，可能在AML发展中起着至关重要的作用。在DNA甲基转移酶（DNMT）家族中，DNMT3A突变常见于多种血液系统恶性肿瘤，相反，DNMT3B在血液系统中的突变鲜见报道。我们前期工作表明，在MLL-AF9诱导的小鼠AML模型中Dnmt3b缺失会导致白血病干细胞（LSC）数量增加，促进细胞周期活跃，进而加快AML进展；此外Dnmt3b的缺失能够与Dnmt3a缺失协同促进AML的发展，导致LSC的进一步增加。本研究将主要运用流式细胞术、基因表达谱检测、DNA甲基化组分析、CRISPR/Cas9等技术和方法深入研究Dnmt3a和Dnmt3b单独及联合缺失导致LSC增殖的机制，同时在AML病人的LSC中验证DNMT3A/3B下游靶基因表达与疾病预后的联系，为临床上复发难治AML患者提供新的治疗策略。

急性髓系白血病（AML）是一种异质性的恶性造血疾病，DNA甲基化修饰作为表观遗传学最重要的调控方式之一，可能在AML发展中起着至关重要的作用。本研究运用流式细胞术、基因表达谱检测、DNA甲基化组分析等技术和方法在MLL-AF9诱导的小鼠急性髓系白血病（AML）模型中研究Dnmt3a、Dnmt3b单独或联合缺失对白血病干细胞（leukemia stem cell，LSC）基因表达谱、基因组DNA甲基化的影响，以致进一步深入研究Dnmt3a和Dnmt3b单独及联合缺失导致LSC增殖的机制。另外我们利用体细胞重编程技术对AML细胞的致病机制进行分析，通过使用标准重编程转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc（称为OSKM）将白血病细胞在小鼠体内进行重编程，我们发现OSKM可以清除小鼠体内的白血病细胞，显著提高白血病小鼠的生存率。相比之下，OSKM对正常造血细胞的影响很小。利用ATAC-seq，我们发现OSKM可以诱导染色质作用于白血病细胞中编码凋亡调控因子的基因附近并诱导基因表达。此外，OSKM还会在早期选择性诱导H3K9me3的下调。这些结果表明，OSKM启动的重编程诱导可以被利用于开发新的抗癌策略。为了分析LSC的起源，我们从成年小鼠的骨髓中分离出不同分化阶段的造血干细胞（HSC）与造血祖细胞（HPC），制备MLL-AF9 AML模型和NOTCH-1 T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）模型。在小鼠白血病模型研究的基础上，我们提出白血病细胞起源于多种有不同自我更新和分化潜能的造血干细胞和祖细胞，并通过LSC的转换进行扩增。为进一步研究分析白血病患者的临床治疗效果，我们通过分析无关供者与同胞供者对异基因造血干细胞移植（HSCT）治疗AML的疗效比较探索对AML病人的更优治疗方案。无关供者（URD）HSCT是缺乏人类白细胞抗原（HLA）相合的同胞供者（MSD）的成人AML患者的理想替代移植方案。总言之，通过对LSC的表观遗传学特性进行研究，结合临床数据分析，我们将致力于为白血病寻找新的治疗策略。