黑视素基因转染双极细胞治疗晚期视网膜色素变性

Retinitis pigmentosa (RP) is a severe blindness leading heritable ocular disease, for which no therapy is available up to date. For late stage RP, the photoreceptors are lost completely, all photoreceptor rescueing will fail. It is only possible to restore visual function by replacement of photoreceptor function. We are going to explore the possibility of restoring visual function for late stage RP via transducing melanopsin (OPN4) gene to bipolar cells. The adino-associated virus will be employed for gene transferring, and the rd1 mice will be used for late stage RP model. In vitro and in vivo experiments will be carried out sequentially. The human neuron (SHFY5Y) will be used for in vitro study, to modify the transfection condition and to see whether the AAV. OPN4 transfection will lead to photosensitivity. In in vivo study, AAVs will be injected subretinally to explore the possibility of transducing OPN4 gene to bipolar cells and its corresponding effect on visual function.

晚期视网膜色素变性(RP)光感受器消失殆尽，但内层视网膜结构相对完整，如何利用相对完整的内层视网膜修复患者视功能，不仅是个有意义的科学问题，更是个有意义的临床问题。本研究拟结合基因治疗和视网膜芯片思路，探讨将正常表达于内层视网膜部分神经节细胞对光敏感的黑视素OPN4基因转染至晚期RP小鼠视网膜双极细胞中，人为赋予双极细胞感光功能，以替代丢失的光感受器功能，从而修复小鼠视功能。实验设计包括体外和体内实验，体外培养人神经母细胞瘤细胞SHFY5Y，应用AAV.GFP摸索转染条件后将黑视素基因转染至SHFY5Y细胞，检测其是否具备感光功能。体内实验采用视网膜下注射AAV.GFP摸索最佳转染条件，再行AAV.OPN4转染目的基因于变性小鼠视网膜双极细胞中，应用激光共聚焦扫描显微镜，免疫组织化学染色,Western Blot等检测转染效率，检查瞳孔对光反射，行为实验等观察转染后小鼠视功能。

晚期视网膜色素变性(RP)光感受器消失殆尽，但内层视网膜结构相对完整，如何利用相对完整的内层视网膜修复患者视功能，不仅是个有意思的科学问题，更是个有意义的临床问题， 也正是本课题研究的重点。本研究应用腺相关病毒（AAV）将正常表达于内层视网膜部分神经节细胞对光敏感的黑视素OPN4基因转染至晚期RP小鼠视网膜双极细胞及水平细胞中，人为赋予这些细胞感光功能，以替代丢失的光感受器功能，从而一定程度上修复小鼠视功能。体外实验显示重组的腺相关病毒（AAV2/5.GFP）可成功将GFP及黑视素基因转染至培养的人神经母细胞瘤细胞SHSY5Y中，应用retinoic acid 和 phorbol ester 12-O-Tetradecanoylphorbol-13- acetate (TPA) 可提高体外转染效率, 而传统的转染辅助剂羟基脲则不能提高AAV2/5.GFP对SHSY5Y的转染，可能与其毒性较大、对SHSY5Y细胞的安全剂量较低有关；钙离子摄像表明转染黑视素基因的SHSY5Y细胞具备感光功能；这一体外实验结果为进一步应用OPN4基因转染至体内神经视网膜细胞，进而修复视功能提供了重要的临床前实验基础。体内实验结果表明，将AAV2/5.GFP打到rd1小鼠视网膜下，可成功转染RPE细胞，水平细胞，muller细胞，但对双极细胞转染效率较低，转染OPN4基因的小鼠瞳孔对光反射功能无明显提高，这一现象可能与对双极细胞转染率低有关。进一步检测不同血清型AAV.GFP对小鼠视网膜细胞的转染情况发现，不同血清型对视网膜的转染效率不同，其中以AAV2/2，AAV2/5，AAV2/8，AAV2/rec2，AAV2/rec3的转染效率较高，但AAV2/9对视网膜无明显转染作用。免疫组织化学染色表明，上述AAV均未能成功转染双极细胞。寻找新型AAV病毒，设计效率较高的启动子，从而提高对双极细胞的转染是本课题后续研究的重点。