逆转ROS介导的内皮细胞caveolin-1/小窝内化在肺癌血管周细胞募集及血管正常化中的研究

Promoting migration,recruitment and covering of pericyte is an effective strategy of tumor vascular normalization, but the regulatory mechanisms remain incompletely understood. SPARC in extracellular matrix, as an important upstream factor of pericyte recruitment signaling pathway, is modulated and degraded by endothelial cytoplasmic MMP-2 directly. .Our preliminary studies have confirmed that scavenging redundant ROS in tumor microenvironment could promote pericyte recruitment, normalize tumor vascular structure and functions. Inhibition internalization of caveolin-1/caveolae in endothelial cells could decrease membrane-anchored MMP-2 obviously. Further studies demonstrate that ROS facilitate Tyr14 phosphorylation mediated caveolin-1 internalization. Accordingly, we hypothesized that ROS induced caveolin-1/caveolae internalization could probably provide guarantee for endocellular transport of MMP-2, thus promote degradation of SPARC protein surrounding endothelial cells, then impair pericyte recruitment..This study will further illustrate the molecular mechanism of ROS mediated aberrance of vascular structure and functions in lung cancer, and to explore possible reverse strategy. This result will provide new theoretical basis for promoting pericyte recruitment primarily onwend the target of SPARC protein and recover mature and stable status of tumor vasculature.

促进周细胞迁移、募集及被覆是肿瘤血管正常化的有效策略，但调控该过程的机制仍未明确。细胞间质中SPARC蛋白作为促周细胞募集信号通路中的重要上游因子受内皮细胞胞浆中MMP-2的直接调控及降解。.本项目的前期研究证实采用抗氧化剂在清除肺癌微环境中多余ROS的同时，使周细胞募集增加，肿瘤血管结构及功能趋于正常；而抑制内皮细胞caveolin-1/小窝内化可明显减少胞膜表面锚定的MMP-2，进一步研究提示ROS可促进caveolin-1蛋白Tyr14磷酸化介导的胞吞内化，据此我们推测，ROS诱导的caveolin-1/小窝内化可能为MMP-2的胞内转运提供保证，从而介导内皮细胞周围的SPARC蛋白降解，阻碍周细胞募集。.本项目将进一步阐明ROS介导肺癌血管结构及功能异常的分子机制并探索潜在可能的逆转策略，为以SPARC蛋白为靶点从源头上促进周细胞募集、恢复血管成熟及稳定状态提供新的理论基础。

肿瘤血管结构及功能的异常对肿瘤的发生发展至关重要，如何促进肿瘤血管正常化亦是目前抗肿瘤治疗的研究热点，其中，促进周细胞的有效迁移、募集及被覆，进而介导血管内皮细胞旁通透性降低是调控肿瘤血管正常化的有效策略。本项目的前期研究证实采用抗氧化剂在清除肿瘤微环境中多余活性氧自由基（ROS）的同时，使周细胞募集增加，肿瘤血管结构及功能趋于正常。.本项目从体内及体外水平探索ROS对肿瘤血管正常化及其调控周细胞募集的具体分子机制。小鼠Lewis 肺癌和黑色素瘤B16肿瘤模型在给予H2O2干预后，免疫荧光显示CD31/Lectin双标的血管较对照组明显减少，周细胞覆盖率（CD31/α-SMA双染）均显著降低，血管形态紊乱，而抗氧化剂组（DPI）的有效血管百分比显著增加(p<0.001); 彩色多普勒超声结果显示，随着氧化应激水平的降低，在体肿瘤组织内血流信号明显增多，VFI 及 VI 显著增加 (p<0.001)。体外采用HUVEC细胞给予H2O2刺激后，ELISA提示，HUVEC胞外SPARC蛋白的含量随着H2O2刺激时间的延长而降低，WB结果可见 HUVEC胞内SPARC在1h时出现浓聚，电镜下可观察到小窝（caveolae）结构增加、深陷，WB提示，pY14-caveolin-1含量增加，且在30min达到峰值，免疫荧光(SPARC/ pY14-caveolin-1双染)显示，在1h时两种蛋白在胞内的共定位最多，且小窝蛋白抑制剂可以抑制H2O2刺激所致的HUVEC胞内SPARC蛋白的浓聚(p<0.05)。进一步研究发现H2O2可促使周细胞包膜外粘附分子E-Cadeherin表达增加，进而阻碍了周细胞的迁移、募集及被覆。最后在动物模型水平验证，LLC和B16肿瘤组织中，组织免疫荧光(SPARC/ pY14-caveolin-1) 染色显示，在氧化应激状态下两种肿瘤组织中SPARC和pY14-caveolin-1均表现为高度重合的共定位状态，而DPI组内两种蛋白出现定位分离。.本研究首次探讨逆转氧化应激后周细胞募集增加、肿瘤血管趋于正常化表现的分子机制： ROS介导内皮细胞小窝／caveolin-1内化，协同转运SPARC蛋白入胞，进而阻断细胞外间质中周细胞募集信号通路。