假单胞杆菌中对硝基酚代谢途径及降解操纵子的表达调控机理研究

对硝基酚（PNP）是一类难降解的硝基芳香烃类环境污染物，利用微生物对污染环境进行生物修复逐渐受到人们重视，因此对其代谢途径和代谢中关键基因的表达调控研究也成为热点。本实验室分离到一株能同时降解甲基对硫磷（MP）和PNP的假单胞菌1-7，构建了其Fosmid基因组文库，筛选到一个含有PNP降解操纵子的12kb片段，并通过实验验证了其中7个编码基因（pdcABCDEFG）的生物学功能。本研究拟利用基因敲除技术突变目的基因，分析原始菌株和突变菌株PNP代谢能力及代谢产物，验证关键蛋白在PNP代谢过程中的功能，从而确定PNP在假单胞菌1-7中的代谢途径。并分析和确定调控蛋白，研究操纵子中启动子的结构特征，进一步在体内和体外验证操纵子中启动子及调控蛋白的相互作用，确定调控蛋白的具体识别序列，进而阐明PNP降解操纵子的表达调控机理。为硝基芳香烃化合物引起的环境问题的生物修复提供理论依据。

对硝基酚（PNP）是一种对人类和动物具有巨大危害的环境污染物。然而，关于PNP降解途径、降解相关的酶及其分子机制的研究报道却十分有限。.假单胞菌1-7是从有机磷污染的活性污泥中分离得到的，它可以降解PNP，在其降解PNP中发现了两个不同的降解中间物：对苯二酚（HQ）和4-硝基邻苯二酚（4-NC）。这表明假单胞菌1-7可以通过两种不同的途径代谢PNP，即是HQ途径和偏苯三酚（BT）途径（也叫4-NC途径），这是第一次确切地报道在一个菌中含有两种不同途径降解PNP。我们通过构建基因组Fosmid文库筛选到一个含有参与PNP降解的基因簇pdcEDGFCBA 的10.6 kb DNA片段，将它们在大肠杆菌中分别进行表达，经功能分析鉴定表明，这7个基因通过表达如下蛋白来参与菌株1-7中 PNP的代谢：pdcA 编码PNP 4-单加氧酶将PNP脱去硝基生成对苯二醌，对苯二醌则经pdcB编码的对苯二醌还原酶催化生成对苯二酚，对苯二酚经pdcDE编码的双组份的对苯二酚1,2-双加氧酶开环降解生成4-羟基粘糠酸半醛，pdcG编码的4-羟基粘糠酸半醛脱氢酶可以将该物质进一步降解生成马来酰乙酸，而马来酰乙酸则通过pdcF编码的马来酰乙酸还原酶还原生成β-酮己二酸，然后进入TCA循环完成最终的降解。.为克隆参与pdcABCDEFG表达的调控蛋白基因，在假单胞菌1-7中我们鉴定了另一个基因簇pdcR1A1R2。其中，pdcA1编码一个FAD依赖的PNP 4-单加氧酶，在大肠杆菌中表达的重组酶PdcA1在体外可以降解PNP和4-NC。pdcR2编码LysR家族的转录因子，凝胶阻滞实验和细菌单杂实验结果显示，PdcR2蛋白通过与两个PNP降解基因簇中的启动子区域的相互作用直接调控PNP降解。进一步的基因敲除和回补实验显示，PdcR2在PNP的降解中起了关键的作用。.本项研究为硝基芳香烃化合物引起的环境问题的生物修复提供理论依据。