DNA修复蛋白Mre11和Sae2对酿酒酵母基因组编辑的影响及机制研究

The strategy of genome editing is realized by introducing DNA lesions into the genome through the nucleases, which can be repaired or mutated by DNA repair system in cells. So far, the genome editing efficiency still needs to be further improved. However, there is little knowledge about the effect of DNA repair on different genome editing tools. Our previous studies showed that the mutations of DNA repair proteins Mre11 and Sae2 have impact on editing efficiency and mutation diversity. Based on this finding, we proposed to employ three different genome editing tools to edit single or double mutant strains of Mre11 and Sae2. By doing so, the effects of Mre11 and Sae2 on the edited cells will be analyzed, including cell survival rate, editing efficiency and mutation diversity. Furthermore, the predominantly engaged DNA repair pathway in the edited cells will be characterized. And efficiently edited cells will be subjected to genome sequencing, thereby analyzing editing efficiency, mutation diversity as well as off-target effect on the whole genome scale. At last, this study would well define the function and the interplay of Mre11 and Sae2 in controlling the response of cells to DNA lesions induced by different nucleases and activating repair pathways, and also reveal the interplay of DNA repair system and genome editing tools in Saccharomyces cerevisiae, thus providing meaningful references of rational design of genome-editing strategies to meet different editing requirements.

基因组编辑策略是通过核酸酶在基因组中引入DNA损伤，然后利用细胞自身的修复系统实现编辑。编辑效率依然有待提高，而DNA修复系统对不同基因组编辑工具的影响知之甚少。前期研究发现DNA修复蛋白Mre11和Sae2突变会影响编辑效率和突变多样性。在此基础上，本项目拟利用三种不同基因组编辑工具对Mre11和Sae2的单突变或双突变菌株进行编辑，分析Mre11和Sae2对被编辑细胞的存活率、编辑效率和突变多样性的影响，鉴定被编辑细胞中起主导作用的修复途径，并通过基因组测序分析被高效编辑的细胞，在全基因组尺度上分析这些细胞的编辑效率、突变多样性和脱靶效应。最终，通过本项目的研究，明确Mre11和Sae2在控制细胞响应不同核酸酶产生的DNA损伤进而激活不同的修复途径中的作用及二者的相互作用关系，解析酿酒酵母DNA修复系统和基因组编辑工具之间的相互作用，为理性设计基因组编辑策略以满足不同编辑需求提供依据。

基因组编辑是近年来飞速发展的一类基因组修饰技术，主要利用CRISPR及Cas蛋白系统，通过在基因组预设位点引入DNA双链断裂，基于细胞自身修复机制——非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）实现片段的随机突变和外源片段的整合突变。当细胞检查到自身发生DNA断裂时，DSB损伤信号传导导致DNA损伤检查点的响应，会刺激细胞周期滞留、自噬、凋亡等一系列生命过程从而实现DSB修复，保证生命过程的顺利进行。基因组编辑策略是通过核酸酶在基因组中引入DNA损伤，然后利用细胞自身的修复系统实现编辑。因此，解析酿酒酵母DNA修复系统和基因组编辑工具之间的相互作用，将是理性设计基因组编辑策略以满足不同编辑需求的重要依据。前期研究发现DNA修复蛋白Mre11和Sae2突变会影响编辑效率和突变多样性。基于此，首先，本项目系统分析了基因组编辑对酿酒酵母DNA的损伤作用及修复响应。其次，分析了Mre11和Sae2对被编辑细胞的存活率、编辑效率和突变多样性、细胞周期和全基因组水平的转录组的影响，从而明确了Mre11和Sae2在控制细胞响应不同核酸酶产生的DNA损伤进而激活不同的修复途径中的作用及二者的相互作用关系。最后，开发了基于mre11-H125N和CRISPR/Cpf1的非同源末端连接的新型基因组编辑策略（mGE），并应用于加速酵母改造进化。总之，本项目解析了DNA修复蛋白Mre11和Sae2对基因组编辑效果的影响及机理，并提高了基因组编辑效果，为进一步提高酿酒酵母基因组编辑效果和性状改造提供了重要手段和依据。