肉牛骨骼肌卫星细胞增殖分化过程中CAPN1和CASP9 基因的表达及分子调控机制研究

Both CAPN1 and CASP9 genes of cattle are the candidate genes relevant to skeletal muscle satellite cell myogenesis and adipogenesis that were found in our previous research. However, the intricate molecular mechanisms and its functions are not clear. Herein we will project a cellular model study to investigate the roles of this two candidate genes during skeletal muscle satellite cell myogenesis via RNA interference technology. In addition to this, the relevant network information for CAPN1 gene and new function proteins would be isolated and identified to explain the roles of CAPN1 gene in the balance exists between myogenic and adipogenic differentiation programme and to examine the plasticity and transdifferentiation of satellite cell that can undergo adipogenic differentiation via gene expression microarray and two-dimensional electrophoresis-mass spectrometry technique. Our results would be helpful to strengthen the knowledge of the molecular mechanism during skeletal muscle growth. A model study of recombinant retrovirus expression vectors system relevant to express shRNAs would be created to investigate the roles of genes associated with meat quality, which would be contributed to the development of intramuscular adipogenesis or marbling and improve meat quality in livestock and poultry.

牛CAPN1、CASP9 基因是申请人在前期研究工作中新发现的与骨骼肌卫星细胞向成脂细胞分化及骨骼肌生长发育相关的两个基因。目前它们的网络调控机制及功能作用还不清楚。本项目拟利用RNAi 技术研究CAPN1、CASP9 基因在骨骼肌肌形成中的表达、网络调控及其功能作用；同时利用骨骼肌卫星细胞具备分化成脂肪细胞潜能的特性，阐明CAPN1 基因在牛骨骼肌卫星细胞向成肌细胞和成脂细胞的转分化平衡中的功能作用，结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期获得与CAPN1 相关的基因网络调控信息并分离鉴定有功能意义的蛋白。研究结果将为解析骨骼肌生长发育的分子机制提供理论数据，并利用逆转录病毒重组体高效表达shRNAs 载体系统建立一种与肉品质相关基因功能研究的模型，为提高畜禽肌内脂肪含量和肉品质的研究提供新的方法和思路。

钙蛋白酶系统（calpain system）是导致蛋白质降解、肉嫩度提高的关键酶，钙蛋白酶 I(CAPN1)基因是参与以上生物学反应的重要成员之一，也是研究肉质性状的候选基因。半胱天冬酶系统（caspase system）分为启动型和执行型，参与细胞凋亡的复杂过程，其中CASP9基因为启动型，接受死亡信号、启动凋亡或激活下游的分子。本研究的目的是探究CAPN1基因、CASP9基因以及相关基因在牛肌肉生长发育过程中的mRNA水平的变化趋势及表达特性。. 通过对肉牛原代肌肉卫星细胞进行体外分离培养并应用差速贴壁法进行纯化，再对细胞进行免疫荧光染色鉴定。分别对在含20%胎牛血清的生长培养基中培养至汇合程度为50%、80%的肌肉卫星细胞和在含2%马血清的分化培养基中培养1d、3d、5d、7d、15d的肌肉卫星细胞进行收集，以候选基因CAPN1、CASP9以及相关基因引物进行实时荧光定量PCR，研究了骨骼肌卫星细胞在增殖和分化阶段CAPN1、CASP9 基因以及相关基因的表达量变化。. 分析实验数据得知在肌肉卫星细胞增殖阶段的汇合指数为50%至80%的时间内，CAPN1基因的相对表达量下降。在细胞汇合指数为80%到细胞分化第3d的时间内，CAPN1基因的相对表达量呈上升趋势，并在3d达到最大值，3d到15d的时间内，CAPN1基因的相对表达量是呈现下降趋势，并且在15d时达到了最低值。总体呈现出先下降后上升再下降的趋势。CASP9基因在细胞汇合度为50%时相对表达量最高，之后在汇合度为80%处降低，在骨骼肌卫星细胞进行分化培养第1d至5d内，CASP9基因相对表达量处于较为稳定趋势，并在第7d达到最低值，之后表达量上升。. 本研究对牛CAPN1基因、CASP9基因在骨骼肌卫星细胞增殖阶段、分化阶段不同状态下的表达水平进行了检测分析，模拟了这两个基因在肉牛骨骼肌生长发育不同时期的表达谱规律。本试验在理论上为阐明牛骨骼肌生长发育的分子机理和相关候选基因的网络调控机制提供了重要的理论依据，为改善肉品质提供一个全新的途径。