超声辐照在活体内将肝细胞直接重编程为β细胞治疗糖尿病及其机制的研究

Evidences suggest that the liver and pancreas both develop from the ventral foregut endoderm, and there is the possibility of the transformation from each other according to the homology. We previously found that liver oval cells could be directly reprogrammed into insulin-secreting cells in vitro by pancreatic duodenal homeobox-1 (Pdx-1) or Pdx-1-VP16 overexpression. However, it is still unknown whether this could be realized in vivo. To avoid the security risks of the traditional reprogramming method by viral vectors, a safe and efficient transfection technique of ultrasound-targeted microbubble is used. The related researches are as follows: (1) To achieve the direct reprogramming of pancreatic β-cell, we screen the effective transcription factors, which mediate the synergistic effects of PDX1 to promote the reprogramming process, and directly transfect the liver cells in diabetic Ins1-DsRed transgenic mice and NOD mice in vivo by ultrasound targeted microbubble. (2) To clarify the effects of transcription factor combinations on epigenetic regulation and the reprogramming mechanism, we analyze DNA methylation and histone modification in reprogrammed β-cells by MSP, western blot, ChIP and other experimental methods. This approach may resolve the problem of β-cells lost in diabetic patients, and provide a new strategy of treatment for diabetes mellitus.

肝脏和胰腺共同起源于腹部前肠内胚层，其发育上的同源性决定了肝脏与胰腺细胞具有相互转化的可能性。我们前期的研究将Pdx1或Pdx1-VP16导入肝细胞可转化为具有分泌胰岛素功能的细胞。然而，能否在体内将肝细胞直接重编程为胰腺β细胞尚不清楚。传统重编程的病毒性载体存在安全隐患，本项目拟采用安全、高效的超声辐照转染技术,在体内将转录因子导入肝细胞直接重编程为胰腺β细胞。具体研究内容如下：①筛选协同PDX1促进直接重编程最佳转录因子组合，利用已建立的超声辐照技术，将转录因子组合导入Ins1-DsRed转基因糖尿病模型小鼠和NOD小鼠肝细胞，使其直接重编程为胰腺β细胞；②采用MSP，Western Blot,ChIP等方法观察重编程后β细胞DNA甲基化，组蛋白修饰水平，研究组合转录因子对细胞表观遗传学调控作用，阐明重编程的作用机制。以解决糖尿病患者体内β细胞缺失的问题，为糖尿病开创新的治疗。

利用细胞发育相关的转录因子，将一种类型功能细胞转变为另一种功能细胞的成体细胞直接重编程技术为临床疑难重症治疗提供了新手段。肝细胞和胰岛细胞共同起源于腹部前肠内胚层细胞，若将糖尿病患者体内的肝细胞直接重编程为胰岛β细胞，有望解决糖尿病患者胰岛β细胞缺乏或不足的问题。传统对细胞的重编程或活体内细胞的直接重编程，主要通过逆转录病毒或腺病毒实现，存在安全性问题。本项目在体外利用纳米转染试剂将Pdx1、Ngn3、MafA、Pax4、Neurod1等不同转录因子组合直接重编程正常小鼠肝细胞系NCTC1469，筛选出Pdx1+ Pax4+Neurod1（PPN）组合为最佳转录因子组合，PPN直接重编程为胰岛素分泌细胞（IPC）的效率为16%。对PPN最佳组合进一步筛选转染时段（12、24、48h），显示最佳间隔为24h，此时直接重编程的胰岛素的释放量最高，在高糖和低糖刺激下，胰岛素释放量分别约为0.39±0.02ng/μg和0.03±0.01ng/μg，直接重编程的IPC的编程效率上升到约21%。将直接重编程的IPC移植到糖尿病小鼠左肾包膜下，发现可明显逆转小鼠的高糖血症。研究进一步在活体小鼠上进行肝脏细胞直接重编程为胰岛细胞的研究，利用水流动力学和超声辐照微泡靶向基因转染方式，将制备的微泡包覆转录因子组合在优化超声辐照参数作用下，将筛选出的最佳转录因子组合，靶向导入到糖尿病模型小鼠肝脏细胞中，在活体内观察到肝脏细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞，发现第6天后血糖开始降低，可以有效地控制血糖至观察期100天，葡萄糖耐受试验证明小鼠的血糖调节能力随时间逐步改善。在直接重编程的肝细胞中，动态观察的胰岛发育相关转录因子的基因（Pdx1、Ngn3、MafA、Nkx6.1、Pax4、NeuroD1、Isl1）和蛋白（insulin、Glucagon），发现直接重编程的IPC可表达上述基因和蛋白，而且小鼠血清中胰岛素也显著升高，表明通过水流动力学和超声辐照转染转录因子可将小鼠肝细胞直接重编程为IPC。由于这种转化过程不经历干细胞阶段，避免了诱导多能干细胞相关的安全性等问题，可解决糖尿病患者体内胰岛β细胞缺乏的问题，将为糖尿病治疗开创新的途径。