一种棉铃虫Cry1A新结合蛋白的鉴定及功能分析

本项目拟以前期研究发现的一种棉铃虫中肠Cry1A新结合蛋白为基础，通过蛋白组学、N端测序、基因克隆、蛋白纯化、同位素标记或SPR技术测定结合能力等手段进一步鉴定蛋白的种类、明确其功能，利用免疫组织定位技术确定这种结合蛋白在棉铃虫中肠的位置，利用PCR、分子杂交、RNA干涉、基因缺失表达等方法，比较在抗Cry1A品系和敏感品系中，该蛋白在基因、转录、翻译、表达各水平的差异。为明确棉铃虫对Bt的抗性机理、制定抗性治理策略提供思路和途径，也为发展监测棉铃虫对Bt产生抗性的分子技术奠定理论基础。

运用SMART技术构建了棉铃虫中肠的cDNA文库，结合双向电泳和差异凝胶电泳及生物质谱测定结果，鉴定了一种新的与抗性相关的Cry1Ac结合蛋白为传铁蛋白。建立了Cry1Ac抗、感品系棉铃虫中肠的转录组文库，通过比对在文库中发现了一段与我们鉴定的传铁蛋白一致性非常高的核酸序列。通过PCR结合RACE技术获得了全长为3177bp、共编码766个氨基酸的基因序列，所得序列与家蚕的传铁蛋白序列同源性较高。比较了抗、感棉铃虫的传铁蛋白氨基酸序列，发现编码抗、感棉铃虫体内传铁蛋白基因的氨基酸序列无突变。利用实时荧光定量PCR技术，采用双内参Taqman-MGB探针的方法对传铁蛋白在棉铃虫各龄期、不同虫态以及抗、感品系间的表达量进行了定量分析，发现该基因在棉铃虫一龄和二龄时期有表达，在其它时期表达量较少或几乎不表达，抗性品系棉铃虫的表达量低于敏感品系，不同的抗性品系棉铃虫比敏感品系分别降低了5.8-11.68倍。试验中我们还发现另外一种新蛋白，即β-1,3-半乳糖基转移酶，也可能与棉铃虫对Bt产生抗性相关，克隆了其基因全长序列，并发现抗性棉铃虫品系的表达量显著高于敏感品系。结果为进一步明确棉铃虫对Bt的抗性机理、制定抗性治理策略提供了依据。