益气化瘀方延缓HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨退变的研究

骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是中老年人群中一种最常见的骨退行性疾病，临床以关节疼痛、活动受限为特征，其重要始发因素及病理改变为软骨退变。软骨组织对低氧环境的适应依赖于低氧诱导因子-1α（HIF-1α），这种适应能力降低，可导致软骨退变。中医认为软骨退变的主要病机在于"气虚血瘀"，中药治疗OA有其独特的优势。.本研究拟利用Col2 Cre酶系统诱导，建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型及体外软骨细胞HIF-1α敲除模型，观察HIF-1α敲除对于椎间盘软骨终板和膝关节软骨组织，软骨细胞形态、增殖凋亡和细胞外胶原、蛋白多糖等的改变，以及临床治疗OA效果显著的益气化瘀方对上述指标的改善作用。以此为"气虚血瘀"致软骨退变的中医病机和益气化瘀方治疗OA提供转基因动物模型和体外细胞模型以及实验依据，并为分析现代生物医学理论与中医气血理论间的内在联系提供新的思路。

正常软骨组织处于低氧环境中，软骨组织对这种低氧环境的适应依赖于HIF-1α。因此当HIF-1α基因敲除后，软骨组织无法维持其正常低氧状态，导致软骨组织营养供应障碍，使软骨细胞处于异常缺血缺氧状态，长此以往，软骨组织会发生退变。.在HIF-1α基因敲除小鼠膝关节软骨藏红固绿染色和HE染色结果表明，HIF-1α-/-小鼠4月龄组软骨形态发生了改变，关节软骨表面不光滑，甚至缺损，软骨分层不清晰，潮线模糊，软骨细胞排列不规则，细胞减少。HIF-1α-/-小鼠6月龄组软骨损伤更加严重。.同时发现，HIF-1α-/-小鼠2.5月龄组椎间盘软骨组织出现溃疡和骨化，细胞分布不均匀，软骨细胞减少。HIF-1α-/-小鼠4.5月龄组椎间盘软骨损伤更加严重，软骨缺损增加，细胞进一步减少。HIF-1α+/+小鼠的椎间盘在两个时间点均没有出现缺损和骨化。.免疫组化染色发现，HIF-1α-/-小鼠4月龄组膝关节软骨中Col II蛋白和Sox-9蛋白表达降低，Col X、MMP-13、VEGF蛋白表达增加。HIF-1α-/-小鼠6月龄组Col II蛋白与Sox-9蛋白表达进一步降低，Col X、MMP-13、VEGF蛋白表达进一步上升。.与HIF-1α+/+小鼠相比，HIF-1α-/-小鼠椎间盘软骨组织中Col II蛋白和Sox-9蛋白表达减少，并且随着增龄Col II和Sox-9蛋白表达量逐渐降低， Col X、VEGF和MMP-13蛋白表达增加，并且随着增龄Col X、VEGF和MMP-13蛋白表达量逐渐升高。.上述结果证明，HIF-1α基因敲除小鼠出现了膝关节以及椎间盘的软骨退变，并且这种退变随着时间的发展而程度加重。.我们采用益气化瘀方对HIF-1α基因敲除小鼠给药干预。HE染色和藏红固绿染色发现，和生理盐水组相比，益气化瘀方组膝关节以及椎间盘软骨部位骨化和缺损减轻，表明小鼠膝关节以及椎间盘软骨的形态破坏受到抑制。通过免疫组化染色发现，膝关节以及椎间盘软骨组织中Col II和Sox-9蛋白的表达增加，提示软骨的基质成分损伤减少。Col X、MMP13 和VEGF蛋白表达减少，表明益气化瘀方干预后，可以延缓软骨组织的破坏。