Nox调控PI3K/Akt/GSK-3β通路在FFA诱发高甘油三酯血症性胰腺炎早期肾损伤中的作用机制初探

Hypertriglyceridemic pancreatitis (HTGP) early prone to kidney injury, the current mechanism is unknown. High concentration of free fatty acid (FFA) may be the main cause of renal injury induced by oxidative stress. Previous studies have shown that NADPH oxidase (NOX) inhibitors can reduce HTGP kidney injury, and found that p-Akt expression increased. Therefore, it is speculated that NOX production of reactive oxygen species (ROS) -regulated PI3K/Akt/GSK-3β pathway may play a key role in FFA-induced renal injury. In this study, P407 combined with sodium taurocholate-induced HTGP rat model as the basis, in vivo and in vitro culture of renal tubular epithelial cells as the object of study. To study the effect of NOX on PI3K/Akt/GSK-3β by NOX inhibitor, PI3K inhibitor and gene silencing technique. It is clear whether FFA can generate ROS by activating NOX, inhibit the activation of PI3K / Akt signaling pathway, induce renal injury, and explore the molecular mechanism of early renal injury.

高甘油三酯血症性胰腺炎（HTGP）早期易发生肾损伤，机制不明。甘油三酯产物FFA是诱发体内氧化应激主要物质，有证据表明Nox在肾脏氧化应激损伤中起关键作用，可刺激ROS产生。另有证据PI3K/Akt/GSK-3β通路与氧化应激损伤密切相关。课题组前期证实Nox抑制剂能减轻HTGP肾损伤程度，并且发现肾脏组织中p-Akt表达增加，因此我们推测Nox生成ROS可能对PI3K/Akt/GSK-3β通路具有调控作用，且此作用可能在FFA诱发肾损伤的过程中发挥关键作用。本项目拟以p-407结合牛磺胆酸钠诱导HTGP大鼠模型作为基础，以体内及离体培养的肾小管上皮细胞（NRK-52E）为研究对象，分别以Nox抑制剂、PI3K抑制剂、基因沉默技术进行干预，明确FFA是否可以通过激活Nox而生成ROS，从而抑制PI3K/Akt/GSK-3β磷酸化进程，促使其下游NF-κB活化，诱发HTGP早期肾损伤。

研究内容：.本项目通过探索高脂血症大鼠急性胰腺炎时胰腺组织、肾脏组织的损伤情况，明确肾脏组织NOX蛋白是否在加重肾脏组织损伤中发挥作用，通过检测下游通路指标变化，进一步明确NOX蛋白激活ROS从而对下游PI3K/Akt/GSK-3β相关通路产生影响，从而证明NOX在高脂血症大鼠急性胰腺炎早期肾脏损伤中作用及机制，在体外使用高浓度的FFA刺激HK-2细胞，进一步明确FFA在急性胰腺炎肾损伤过程中的作用机制。.重要结果：.本研究使用腹腔持续注射P-407诱导高脂血症模型，14天后，采用腹腔两次注射L-Arg的方法诱导急性胰腺炎模型。研究结果发现高脂血症大鼠急性胰腺炎相关肾损伤较非高脂血症大鼠加重，高脂血症大鼠诱导胰腺炎后各时间点的肾脏组织NOX4表达水平均高于高脂对照组，且在造模24h后达到顶峰，采用Western blot法、免疫组化染色法及免疫荧光染色法对肾脏组织NOX4、p-Akt、GSK-3β、NF-κB、TNF-α、MPO及CD68蛋白表达水平进行检测。TUNEL染色检测肾脏细胞凋亡水平。高脂血症大鼠急性胰腺炎时过量的FFA通过激活肾脏NOX4蛋白，产生过量ROS参与调控Akt/GSK-3β通路，释放大量炎症介质加重肾损伤； Apocynin（NADPH氧酶抑制剂）可通过抑制NOX4蛋白表达水平，减轻高脂血症大鼠急性胰腺炎时肾脏损伤和炎症反应。选用HK-2细胞进行了体外实验，发现高浓度的FFA可刺激HK-2细胞的NOX产生过量ROS，调节Akt/GSK-3β通路，促进细胞损伤。这些实验结果提示，在高脂血症性急性胰腺炎中，高浓度的FFA可激活肾脏组织NOX蛋白，增加ROS的释放，继而通过调节Akt/GSK-3β通路和NF-κB通路，促进炎症介质的过量释放及细胞凋亡增加，最终引起肾脏损伤加重。.科学意义：.高脂血症性急性胰腺炎易在病程早期出现胰外脏器功能和结构的损伤，导致疾病向重症胰腺炎进展，引起高死亡率。急性胰腺炎患者一旦并发肾功能障碍，肾脏代谢分泌能力受损，将进一步加重病情，死亡率可显著增高，本项目研究结果已阐明NOX及其诱导的下游通路在HTGP发病早期肾损伤中具有重要的作用，通过早期干预NOX的活性，可能可有效预防HTGP早期肾损伤的发生。防止肾损伤演变发展为ARF，防治MOF发生。具有重大的科学价值。