桑葚花色苷的代谢及对铅致神经细胞损伤的营养干预机制研究

Lead (Pb) is a toxic heavy metal, which is commonly found in the natural environment. Low-level Pb exposure with very strong neurotoxicity can cause nerve cell damage and consequent irreversible damage to children's cognition, learning and memory ability. The effects of Pb poisoning have attracted extensive attention lately. Nutritional intervention is an effective method to prevent lead poisoning. Anthocyanins are natural polyphenol pigments that widely distribut in plant-based diet. They can penetrate the blood brain barrier and possess nerve protective effect. Based on our previous studies, the metabolites of mulberry anthocyanins monomer will be further indentified and its metabolism regularities will be investigated. The project is also to evaluate the effects of mulberry anthocyanins monomer and its metabolites on learning and memory function in Pb exposed rats, obtain the active ingredient with the good ability to protect the nerve cells lesion. The intervention mechanism of the active ingredient will be further studied from the molecular level, including Ca2+，NMDA and other receptors，the expression of cognitive proteins and genes in the cAMP-PKA-CREB signaling pathways. The investigation will clarify the molecular mechanism on intervention effect to lead-induced nerve cells lesion by active ingredient and confirm the key factor in intervention process. The project will provide a scientific basis for the application of the mulberry anthocyanins, and prevention the lead poisoning by nutrition intervention.

铅是广泛分布在自然环境中的有毒重金属，即使是低水平暴露，仍具有很强的神经毒性，会造成神经细胞损伤，对儿童认知、学习和记忆能力等产生不可逆损害，铅中毒的危害性已受到广泛关注。营养干预是预防铅中毒的有效方法，花色苷是植物性膳食中广泛分布的天然多酚类色素，能透过血脑屏障，具有神经保护作用。本项目在申请人前期研究的基础上，进一步分析鉴定桑葚花色苷单体的代谢产物，探讨代谢规律；考察桑葚花色苷单体及其代谢产物对铅致大鼠学习记忆功能的影响，获得干预铅致神经细胞损伤效果好的活性物质；从分子水平层次研究活性物质对神经细胞内cAMP-PKA-CREB信号传导通路中的Ca2+、NMDA等受体、认知蛋白表达、基因表达等的干预情况，从而阐明活性物质对铅致神经细胞损伤干预的分子机制，确定干预的关键因子，为桑葚花色苷的应用提供科学依据，为通过饮食营养干预途径预防铅中毒提供基础。

本项目研究了桑葚花色苷的代谢及对铅致神经细胞损伤的营养干预机制。采用Amberlite XAD-7HP大孔树脂和高速逆流色谱法（HSCCC）从桑葚粗提物中分离纯化得到三种高纯度的桑葚花色苷单体，结构鉴定显示，这三种花色苷单体分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、矢车菊素-3-O-芸香糖苷（C3R）、飞燕草素-3-O-芸香糖苷（D3R）。这三种桑葚花色苷单体在模拟胃、肠液及鼠肠道菌群中的代谢规律研究结果表明，在模拟胃液中，花色苷主要以原型的形式存在，少量花色苷代谢成甲基化的形式；在模拟肠液中，花色苷发生降解与转化，C3G与C3R主要代谢为原儿茶酸（PCA）与2,4,6-三羟基苯甲醛，D3R主要代谢为没食子酸与2,4,6-三羟基苯甲醛；在鼠肠道菌群试液中，三种桑葚花色苷单体在前4 h迅速代谢，C3G在6 h代谢完全，C3R和D3R到8 h代谢完全，C3G和C3R主要代谢为PCA、香草酸、对香豆酸和2,4,6-三羟基苯甲醛；D3R主要代谢为没食子酸、丁香酸和2,4,6-三羟基苯甲醛。采用健康SD大鼠，研究了C3G在大鼠体内的代谢，结果表明，C3G在体内的动力学参数符合一室模型，雄性和雌性大鼠之间的代谢动力学参数（t1/2，Cmax，Tmax，MRT和AUC0→∞）无显著性差异；HPLC-ESI-MS/MS定性分析结果显示，脏器（脑、肝、肾、胃、肠）、血液及排泄物（粪便、尿液）中均有原型及甲基化花色苷检出，而代谢产物以酚酸或酚酸衍生物为主。采用大鼠慢性铅暴露模型，研究了桑葚花色苷单体C3G及其主要代谢产物之一PCA对铅致大鼠学习记忆功能的影响，结果表明，C3G及PCA可提高大鼠的学习记忆功能，抑制铅诱导大鼠脑、肝和肾组织的氧化损伤。采用大鼠慢性铅暴露模型，研究了桑葚花色苷单体C3G对铅致神经细胞损伤的干预机制，研究结果表明，C3G可通过调节神经元表达通路的相关蛋白和基因（NMDANR1、NMDANR2、PKA、PKC、nNOS、CREB、p-CREB、c-fos、c-jun）的表达，改善铅诱导的学习记忆能力损伤。可见，桑葚花色苷C3G对铅致大鼠学习记忆损伤具有较好的改善作用，在通过桑葚花色苷饮食营养干预途径预防铅致神经细胞损伤具有较好的应用前景。