结合活细胞的3D打印构建生物活性小口径人工血管

There are two main strategies for facilitating the small-diameter vascular cellularization. One is to produce a tissue-engineered vascular graft (TEVG) with self-derived cells in vitro, but it requires a long waiting time and high cost. The other is to modify vascular scaffolds with cell growth factors for facilitating its regeneration in situ. Although vascular graft regeneration in situ gained certain success for rapid endothelialization, the cells could not adequately infiltrate into the scaffolds, which limit the smooth muscle cells regeneration. To conquer this challenge, we will fabricate a vascular graft with rapid cellularization by 3D bio-printing technology. The vascular graft will be designed by inner, middle and outer three layers. The raw polymers with different biodegradable rates will be screened to ensure the mechanical properties and prevent vascular calcification. The inner layer will be fabricated with hyaluronic acid hydrogels modified by SDF-1 to anti-coagulation and accelerate the endotheiliazation. In the middle and outer layer, the different mass ratio of poly(glycerol-sebacate) (PGS) to poly caprolactone (PCL) will be used to tune the biodegradable rates. In the middle layer, the high ratio of PGS to PCL will be printed in circumferential direction as scaffold. And the smooth muscle cells loaded in the hydrogel will be printed circumferentially to guide its oriented regeneration. The lower ratio of PGS to PCL will be printed as outer layer of scaffold, to ensure the mechanical properties after transplantation. The project will provide new options of rapid production of small-diameter vessels.

通过体外细胞培养制备组织工程血管和制备活性血管支架进行体内细胞募集是解决小口径血管细胞化的两种方式。组织工程血管存在制备周期长的问题，而体内募集虽然对于快速内皮化取得了显著的效果，但细胞向血管支架中层迁移速度太慢且无取向，使平滑肌的取向生成受到了限制。本项目将结合3D生物打印技术，将体内再生困难的平滑肌细胞（SMCs）通过3D打印的方式实现，制备可快速细胞化的人工血管。我们拟将人工血管分为内中外三层进行设计，透明质酸凝胶作为内层，并通过缓释SDF-1促进内皮细胞的有序生成。在中层和外层通过PGS与PCL的梯度分布调节其降解速率。中层用高含量的PGS作支架材料，结合SMCs一起进行取向打印，解决平滑肌取向再生困难的问题。外层用较低含量的PGS作为支架材料，以保证移植初期，血管的力学性能。通过对SMCs的取向控制和对血管材料的降解调控促进小口径人工血管的体内再生。

天然血管壁的内、中、外层分布的不同种类细胞均具有其固有的排列方式，并发挥着相应的功能。设计和制备出能引导人工血管拟天然再生的人工血管之间仍是一个重大的挑战。近年来的研究表明，稳定的平滑肌层也会促进稳定的内皮层的再生，而取向的结构可以促进平滑肌的取向再生，本项目通过对人工血管的材料和结构进行精确的设计，从而促进血管的逆天然再生，研究过程中主要取得了以下几个方面进展：1. 通过可牺牲的糖丝模板洗脱制孔的方法，制备了具有联通的三维的取向微通道结构的人工血管，并对其进行了体内、体外评价。体外细胞实验结果表明微通道结构能促进血管平滑肌细胞在体外的迁移、取向排列、伸长和收缩表型蛋白表达。植入大鼠主动脉缺损模型后，具有高度连通性的周向排列的微通道同时改善了血管平滑肌细胞的浸润、排列整齐、胞外基质的取向沉积、快速内皮化以及巨噬细胞M2表型的转换。2. 另外，我们还制备了具有取向微米纤维结构的小口径人工血管，通过体内评价发现，取向的微米纤维也可诱导平滑肌的取向再生。3. 最后，我们设计了不同降解速率的小口径人工血管（聚乳酸-己内酯（PLCL），聚己内酯（PCL）取向纤维结构），并进行了长达18个月的体内评价。取材后的分析结果显示，降解较快PLCL材料的力学性能降低并表现出与天然血管类似的力学特性，PLCL的降解改善了人工血管的再生，包括形成较厚的新生血管层，密集的细胞外基质沉积，以及明显的收缩和舒张功能的恢复。但是，我们发现相比于降解较慢的PCL，降解较快的PLCL血管产生的酸性环境容易导致钙化的发生。综上所述，我们通过三维取向结构促进了血管平滑肌层的再生，同时促进了稳定的血管内皮化；通过调节材料降解性能和力学性质来促进血管组织的重塑。本研究为组织工程血管移植物的设计和制备提供了新的思路，长期的体内评价也为小口径人工血管的临床转化提供了可参考的研究基础。