红霉糖多孢菌转录因子PhoP调控网络构建及其参与红霉素合成代谢调控的研究

Saccharopolyspora erythraea is a Gram-positive filamentous bacterium used for the industrial-scale production of erythromycin A which is of high clinical importance. To elucidate the mechanisms underlying erythromycin biosynthesis, we sequenced the whole genome of a high-producing strain (E3) obtained by random mutagenesis and screening from the wide-type strain NRRL23338, and compared E3 with NRRL23338 at both the genomic level and the transcriptomic level. We observed that global phosphate regulator PhoP maybe play an important role in phosphate-nitrogen nutrition stress responses and secondary metabolism in S. erythraea. In this study, we will identify the PhoP regulon by using bioinformatics, phoP mutation, and comparative transcriptomic analysis, and also identify the regulators (including their target genes) mediating phosphate, nitrogen metabolism and erythromycin biosynthesis. We further will build and confirm the regulatory network of PhoP-GlnR-AfsR to elucidate the precise mechanisms underlying the erythromycin biosynthesis in S. erythraea.

通过红霉糖多孢菌高产菌株的基因组测序及发酵过程比较转录组研究，我们发现磷代谢调控因子PhoP在细胞内碳氮磷等营养组份代谢平衡、应激响应及其红霉素合成代谢调控中可能有重要作用。本课题利用生物信息学工具全基因组搜寻Pho-Box结合序列，phoP基因敲除及转录组差异分析等方法确定PhoP调节组及调控网络，探讨PhoP通过GlnR介导调控氮代谢基因转录作用及细胞内氮-磷营养平衡调控及应激机制，鉴定PhoP参与抗生素合成代谢调控的介导蛋白，阐明红霉素合成调控机理并设计相应的代谢工程策略，初步探讨基于PhoP调控机制的菌种改造及发酵工艺优化方法，提高红霉素发酵菌种改良及过程优化效率。

本课题鉴定了红霉糖多孢菌磷代谢调控因子PhoP、氮代谢调控因子GlnR和N乙酰葡萄糖胺代谢调控因子DasR的调节组 (regulon)，完成了三种调控蛋白结合序列分析(Binding-Box)、靶标基因鉴定及调控网络构建；发现了红霉糖多孢菌三个柠檬酸合酶基因 (编码TCA循环第一步反应的关键限速酶)均受GlnR，DasR和CRP等全局营养感知转录因子的转录调控，显示了氮碳营养状态对TCA循环的影响；发现了GlnR直接转录调控蛋白质翻译后酰基化修饰系统，首次鉴定乙酰化谷氨酰胺合成酶GSI-beta具有分子伴侣功能，增强了GlnR的转录活性，形成一种新的氮代谢正反馈调控回路 (GlnR-GS-GlnR)；进一步研究了GlnR和PhoP对碳源代谢的调控效应，发现GlnR直接激活大部分基于ABC转运体系的糖的转运及利用，并且GlnR和PhoP也激活alpha-糖苷酶及beta-糖苷酶的基因转录；研究了PhoP及DasR对红霉糖多孢菌的生长、分化及次级代谢的影响，揭示了一种维持细胞内氮-磷营养平衡的反馈调控回路及对红霉素合成的调控作用，建立了整合初级代谢及红霉素合成代谢的营养感知蛋白介导的交互网络作用调控网络 (GlnR-PhoP-BldD-ery)，鉴定多种红霉素合成相关调控因子，基因改造提高红霉素产率56%。这些研究为我们进一步阐明放线菌营养代谢及抗生素合成调控的分子机制，设计新的代谢工程策略，获得抗生素高产菌株提供了理论基础。项目按计划完成，取得预期成果。项目实施以来已发表项目标注SCI论文25篇，包括Proc Natl Acad Sci USA (2篇)，Mol Microbiol (2篇)，J Bacteriol (2篇)，J Biol chem (1篇)，Appl Environ Microb (2篇)和Appl Microbiol Biot (4篇)等；已申请中国发明专利5项，授权专利2项。培养博士后2名，培养博士研究生7名，硕士研究生12名。