基于人工小RNA调控优化光合蓝细菌中β-石竹烯的生物合成

Development of “liquid sunshine” could be the one of key technologies to deal with the issue of future fossil fuel depletion. β-Caryophyllene is a terpene compound with high-performance and has attracted attention for its potential application as a jet fuel. The high temperature and high light-tolerant photosynthetic cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973 (hereafter Synechococcus 2973), whose doubling time can be as short as 1.5 h, has great potential for synthesizing β-caryophyllene using sunlight and CO2. Nevertheless, the two scientific issues, i.e., “designing strategies for quantitative gene regulation in cyanobacteria” and “tools and principles for re-directing metabolic flux” remained in Synechococcus 2973 limit the deep research of terpene biosynthesis. Based on our previous studies on small RNA regulation tools in cyanobacteria and β-caryophyllene synthesis in engineered Synechococcus 2973 chassis, here we will address two scientific questions in Synechococcus 2973. The research includes: I) Elucidation and developing quantitative gene regulation tools through rational design of artificial small RNA regulatory elements and the their controllable coupling with various expression elements, to achieve quantitative inhibition or effective blocking of single gene or multiple genes; II) Fine regulation of metabolic flux in the β-caryophyllene producing Synechococcus 2973 via efficient inhabitation of non-essential genes and quantitative regulation of essential genes using artificial small RNAs, to realize increasing supply of precursors and to reduce consumption of competitive pathways. The proposed research will provide important molecular tools and strategies for gene regulation and terpene synthesis in cyanobacteria.

发展“液态阳光”被认为是解决未来化石燃料枯竭问题的关键技术之一。β-石竹烯是高性能的萜烯化合物，作为潜在的航空燃料备受瞩目。新型蓝细菌底盘聚球藻2973，倍增时间短至1.5h且耐受高温高光，利用光和二氧化碳合成β-石竹烯具有很大前景。即便如此，聚球藻2973中“基因定量调控工具的构建策略”及“代谢流重分配的设计原则”两个科学问题限制了萜烯合成的深入开展。基于申请人前期在蓝细菌中构建的小RNA调控工具及β-石竹烯合成底盘，本项目拟在聚球藻2973中开展如下研究：一）定量调控工具的策略解析及构建，通过对小RNA调控元件的理性设计和表达元件的可控偶联，实现对单、多基因的定量抑制或有效阻断；二）β-石竹烯合成底盘中代谢流的精细调控，通过人工小RNA对非必需基因的高效抑制和必需基因的定量调控，实现代谢流的重分配和β-石竹烯的高效合成。本项目将为蓝细菌中基因调控、萜烯合成提供重要的分子工具及研究策略。

光合蓝细菌可利用光能和二氧化碳分别作为唯一的能源和碳源进行自养生长，随着合成生物学技术的兴起，已成为绿色生物制造的重要底盘。此外，随着我国双碳目标的提出，基于蓝细菌的二氧化碳转化成为研究热点。发展基于蓝细菌的“液态阳光”技术或成为解决未来化石燃料枯竭问题的关键之一。β-石竹烯是高性能的萜烯化合物，作为潜在的航空燃料备受瞩目。新型蓝细菌底盘——聚球藻2973（Synechococcus elongatus UTEX 2973），倍增时间短至1.5 h且耐受高温高光，利用光和二氧化碳直接合成β-石竹烯极具前景。本项目基于在蓝细菌构建的小RNA调控工具及β-石竹烯合成底盘的工作基础，在聚球藻2973中研究了“基因定量调控工具的构建策略”及“代谢流重分配的设计原则”两个科学问题，并通过对小RNA调控元件的理性设计和表达元件的可控偶联，实现了对单、多基因的定量抑制或有效阻断随后通过人工小RNA对非必需基因的高效抑制和必需基因的定量调控，增加前体物质的供给、减少竞争通路的消耗，实现代谢流的重分配和β-石竹烯的高效合成。项目实现了目前蓝细菌中报道的β-石竹烯的最高产量（96 hβ-石竹烯产量达到~212.37 μg/L），顺利完成了项目的预期任务。此外，受项目开发的技术支撑及启发，该技术随后被成功应用到肌醇、甘油葡萄糖苷等多个产品的的合成当中，证明了所开发的小RNA调控策略在蓝细菌产物合成调控中的普适性，并且证明了蓝细菌可作为“光驱动的细胞工厂”用于二氧化碳的转化及化学品的绿色合成。项目共计发表受资助论文11篇（其中SCIE论文8篇），申请发明专利2项，其中1项已获得授权。