错配修复基因MLH1调控自噬在低剂量辐射下HRS向IRR转变中的作用及机制

Low-dose radiation hypersensitivity or increased radiation resistance (low-dose hyperradiosensitivity/increased radioresistance, HRS/IRR) phenomenon have drawn great interest in the past few years due to its potential clinical value, but its exact molecular mechanisms is still unclear. We previously demonstrated that expression of mismatch repair gene MLH1 and autophagy level in HRS/IRR positive cancer cells were significantly increased after low dose radiation and cells underwent transition from HRS to IRR at the same radiation dose. Moreover, knockdown of MLH1 gene expression or inhibition of autophagy induced enhanced HRS phenomenon in HRS/IRR positive cancer cells, indicating the potential role of MLH1 in the HRS/IRR response via autophagy regulation. In this project, we will further study the molecular basis of MLH1 via autophagy regulation in the HRS/IRR phenomina after low-dose ionizing radiation, and explore the effect of MLH1 modulating on the radiosensitivity. Successful completion of this study should provide new insights into the mechanism of HRS/IRR phenomenon, and provide experimental basis for individualized clinical application of low-dose radiation and hyperfractionated radiotherapy.

低剂量放射超敏感性或增强的放射抵抗性(low-dose hyperradiosensitivity/increased radioresistance,HRS/IRR)现象自发现以来,以其潜在临床应用价值，一直是放射生物学领域研究的热点，但发生机制仍不清楚。我们前期发现：HRS/IRR阳性肿瘤细胞在低剂量辐射下错配修复基因MLH1表达及自噬水平显著增加，且在该辐射剂量点细胞由HRS向IRR转变。进一步下调MLH1基因表达或抑制自噬后，细胞呈现HRS现象增强，提示MLH1在低剂量辐射下可通过调控自噬信号通路诱导HRS向IRR转变。本课题拟在此基础上，进一步解析MLH1基因在低剂量辐射下通过自噬信号通路对HRS/IRR现象的作用及机制，在细胞和动物水平观测调控MLH1基因对低剂量辐射放疗敏感性的影响，为HRS/IRR现象奠定新的理论依据，以及低剂量放疗、超分割放疗的个体化临床应用提供实验基础。

背景：放射治疗是肺癌的重要治疗手段之一，放疗过程中出现的放疗抵抗及放射线对周围正常组织的损伤，限制了其在临床中的应用。研究发现，在低剂量辐射时细胞存在超敏感现象（HRS），即在<1Gy 的辐射剂量范围内，在极低剂量（<0.3-0.5Gy）时单位剂量细胞杀伤性增强，而在随后的剂量区域细胞则出现相对的放射抗拒（IRR）。由于HRS/IRR现象的存在，在同等总剂量下，相比于常规剂量分割放疗，低剂量分割放疗可显著提高肿瘤细胞的放射敏感性，提高肿瘤控制率和保护正常组织。目前针对肿瘤细胞中呈现HRS的机制一直研究较少，这种放疗超敏现象能否在常规放疗中应用也是我们关注的问题。.目的：本研究拟探讨ATM调控自噬在低剂量辐射下对肺癌放射敏感性的影响，并进一步研究其在HRS向IRR转变中的作用及具体机制。.研究方法与内容：通过克隆形成实验验证A549和H460细胞HRS/IRR现象的改变，Western Blot、PCR、电镜验证不同低剂量辐射下A549和H460细胞ATM蛋白的磷酸化水平以及细胞自噬水平的改变。通过siRNA转染敲低ATM的表达，转录组学测序分析筛选出ATM调控的与自噬通路相关的分子，并通过PCR和Western Blot对检测结果进行验证。通过转录组学测序筛选出差异代谢物，并通过克隆形成和Western Blot对检测结果进行验证。裸鼠移植瘤模型验证细胞实验的结果。.结果：（1）高表达ATM的A549细胞，显示HRS/IRR阳性，低表达ATM的H460呈现HRS/IRR阴性。ATM的表达降低后A549细胞的HRS现象增强，同时H460细胞的放疗敏感性也有所增强，该现象与自噬基因p-JNK和AMBRA1的增加相关。（2）细胞碳代谢产物DL-Norvaline抑制了低剂量辐射下A549细胞的自噬水平，同时，DL-Norvalin增加了A549细胞ATM、JNK和AMBRA1的表达水平。（3）小鼠实验验证了ATM对自噬和代谢的调节以及在HRS/IRR中的作用，.结论：ATM可能通过p-JNK和AMBRA1来影响自噬进而参与 HRS/IRR 现象的调节。自噬与细胞碳代谢产物DL-Norvalin相互作用，参与调节细胞的低剂量辐射敏感性。