利用基因芯片技术研究营养因子调控奶牛肝脏能量代谢的分子机制

We design one experiment to study on molecular mechanisms of dietary factors regulating liver energy metabolism in Holstein heifers by using genechip technique. Sixteen yearling Holstein heifers will be used to determine the effect of dietary corn silage inclusion (20, 40, 60, or 80% of DM) on liver energy metabolism by analyzing gene expression profiling verified by RT-PCT analyzing mRNA expression of ATP Synthase, Na+/K+-ATPase, PCNA,UCP2 and ubiquitin which are thought to be important in tissue energy metabolism. Heifers will be fed at similar energy levels. Diets will be formulated so that the requirements of protein, vitamins and minerals were met or exceeded (NRC beef 1996). Additionally, diets will be formulated to maintain the same ratio of CP:metabolizable energy (ME) in order to minimize potential effects due to differences in CP intake across diets. Blood, feed, fecal samples will be collected on d1, d7, d14. DMI and BWG will be recorded to calculate net feed efficiency. Liver will be biopsied on d14 to analyze differential gene expression by Affymetrix Genechip. RT-PCR and Western blotting will be adopted to verify the results from Genechip. In this study, we will try to test our hypothesis that there are certain relationships between the nutritional factors and deferential hepatic gene expression related to energy metabolism in cattle.

本研究拟通过肝脏活体微创采样技术、基因芯片技术、实时定量PCR技术和Western Blotting蛋白分析技术等，针对牛肝脏能量代谢，通过四种梯度的粗饲料采食量引起饲料营养成分变化，从分子水平检测营养因子对牛肝脏基因表达谱的影响，把标志肝脏代谢功能和组织细胞能量平衡的基因差异表达信息整合分析，从基因组学和蛋白质组学结合的角度，揭示营养成分对反刍动物肝脏能量代谢影响的分子机制，探索性地研究可能与调控动物饲喂效率相关联的差异表达的基因及其相关的生物学功能，分析肝脏基因差异表达与饲料梯度改变的线性关系并建立模型，为使用饲料调配手段提高反刍动物饲料利用效率提供理论依据。

本研究在总结前人的研究基础上，采用国际上先进的奶牛活体肝穿刺采样、RNA-Seq、实时定量PCR技术和Western Blotting蛋白分析技术等，通过梯度改变粗饲料采食量引起饲料营养成分变化，从以下四个方面探究了不同精粗比限饲日粮对荷斯坦后备奶牛能量代谢和瘤胃适应性的影响：（1）不同精粗比限饲日粮对荷斯坦后备奶牛营养物质采食量、反刍行为、瘤胃发酵、消化降解和生长性能的影响；（2）不同精粗比限饲日粮对荷斯坦后备奶牛瘤胃微生物和代谢物变化的影响；（3）不同精粗比限饲日粮对荷斯坦后备奶牛肝脏mRNA表达谱的影响；（4）不同精粗比限饲日粮对荷斯坦后备奶牛肝脏和血液代谢物和能量代谢相关蛋白含量的影响。为指导荷斯坦后备奶牛饲养管理提供理论基础和实践指导，为提高后备牛饲喂效率打下了良好基础。结果显示，在等能饲喂不同精粗比日粮的情况下，随着日粮精饲料含量的增加，干物质和中性洗涤纤维采食量线性降低，但是非纤维性碳水化合物采食量线性增加；总反刍时间线性降低；瘤胃氨氮浓度、丙酸和丁酸比例线性增加；干物质和粗蛋白表观全肠道消化率线性增加；但是对大部分的血液指标和体尺没有显著影响。校正后的日增重和饲喂效率（去除肠道内容物）随着日粮精饲料含量的增加而线性增加。随着日粮精饲料水平的增加，在纤维分解菌中纤维杆菌属、琥珀酸单胞菌属、Polyplastron和Ostracodinium的相对丰度显著线性降低，在非纤维性分解菌中内毛属的相对丰度显著线性增加。瘤胃代谢物中氨基酸、脂类、有机酸和碳水化合物随着日粮精粗比的改变也发生了显著变化。通过功能分析发现，不同精粗比限饲日粮显著影响了荷斯坦后备奶牛肝脏的脂质代谢，尤其是胆固醇和类固醇代谢；有9个关键的基因涉及其中；这一结果与肝脏和血浆中总胆固醇含量变化相一致。结合前边的瘤胃发酵指标和饲喂效率，能够推测出不同精粗比等能限饲奶牛机体能量利用效率发生了变化；在高粗料饲喂奶牛中瘤胃乙酸比例和胆固醇合成增加可能与其能量利用效率降低有关。