LncRNA-XIST, miRNAs和TGF-beta信号通路构成ceRNA机制介导间充质干细胞成软骨分化的表型稳态和表型转换

Tissue engineering is a promising method to repair the degenerated cartilage. The phenotype homeostasis and transition of cartilage remains the key of the area. The appropriate TGF-beta stimulation maintains homeostasis of chondrocyte phenotype, and the excessive TGF-beta stimulation initiates the phenotype transition. However, the underlying mechanisms are not understood. Recent studies revealed that miRNAs, mRNAs and lncRNAs could form ceRNA. The proposer’s previous work proved that miR-193b,381 and lncRNA-XIST participated in the regulation of TGF-beta signaling pathway and chondrogenesis. Based on these works, for the first time a hypothesis is proposed that the ceRNA of lncRNA-XIST, miR-193b,381 and several important genes of TGF-beta signaling pathway mediates the phenotype homeostasis and transition of cartilage under different strength of TGF-beta activation. The current proposal will adopt the RNA immunoprecipitation and the luciferase reporter assay to study the above ceRNA mechanism and its effect. The key problem of the phenotype homeostasis and transition of cartilage would be resolved, and the tissue engineered cartilage would be refined.

组织工程技术是修复软骨退变的理想方法，软骨细胞表型稳态和表型转换是该领域的关键。适当的TGF-beta刺激可维持软骨细胞表型稳态，过度的TGF-beta刺激将导致表型转换。然而其内在机制尚不清楚。最近研究表明，miRNAs, mRNAs和lncRNAs之间可形成ceRNA机制。申请人前期研究发现miRNA-193b,381和lncRNA-XIST参与调控TGF-beta信号通路和成软骨分化，在此基础上首次提出lncRNA-XIST可能与miRNA-193b,381以及TGF-beta信号通路的多个重要基因构成ceRNA机制，介导不同强度TGF-beta信号通路调控软骨细胞表型稳态和表型转换的作用。本项目拟采用RNA immunoprecipitation和荧光素酶报告实验等技术从体内和体外层面研究上述ceRNA机制及作用，有望解决软骨细胞表型稳态和表型转换的问题，改善组织工程软骨性能。

组织工程技术是修复软骨退变的理想方法。适当的TGF-beta刺激可启动间充质干细胞成软骨分化、维持软骨细胞表型稳态，然而其内在机制尚不完全清楚。最近研究表明，miRNAs, mRNAs和lncRNAs之间可形成ceRNA机制调控多种生物学过程。申请人前期研究发现miRNA-193b,381和lncRNA-XIST参与调控TGF-beta信号通路和成软骨分化，有必要深入研究证实上述ceRNA机制的调控。.主要内容：.1).在体内小鼠胚胎肢芽中，采用原位杂交检测lncRNA-XIST表达。.2).在体外成软骨分化模型中发现lncRNA-XIST参与早期成软骨分化过程，并与miR-193, 381成反向关系。.3).采用mimic/inhibitor干预miR-193,381，发现miR-193,381均可对lncRNA-XIST和TGF-beta信号通路产生抑制作用。.4).利用SAM系统构建双慢病毒转染的过表达XIST的稳转株ATDC5。.5).在过表达XIST的ATDC5稳转株中lncRNA-XIST对miR-193,381起到抑制作用，而促进TGF-beta信号通路的激活和早期分化。.6).荧光素酶报告实验证实miR-193对 lncRNA-XIST发挥转录后抑制作用，而miR-381对lncRNA-XIST的转录后抑制不明显。.7).发现lncRNA-XIST表达可被TGF-beta信号通路激活，且呈现剂量依赖关系。.结果：在早期成软骨分化过程中，lncRNA-XIST可海绵吸附miR-193b，抑制其表达，去除miR-193b对TGF-beta诱导的间充质干细胞成软骨分化的阻遏作用。同时TGF-beta可诱导lncRNA-XIST表达。因此，该lncRNA-XIST和miR-193b构成的ceRNA机制与TGF-beta形成的正反馈机制参与并促进了早期成软骨分化过程，推动间充质干细胞获得软骨表型。.而miR-381以一种非碱基互补配对直接结合的方式，同样参与介导了lncRNA-XIST对早期成软骨分化的调控作用。.上述研究结果丰富了目前对ceRNA机制调控间充质干细胞成软骨分化的理论内容，为进一步提高组织工程软骨的性能和工艺奠定理论基础。.本项目由于实施过程中遭遇疫情影响和研究生毕业，导致缺乏人力，因此进度显著落后，目前完成全部实验部分工作，但仍未能发表成果。