DNA甲基化参与山羊初情期启动的作用和机制

The early and late onset of puberty is critical to reproductive performance and production payoff in animal. However, the mechanism underlying the onset of goat puberty is still poorly understood. Recently, DNA methylation was reported to be associated with the onset of puberty, which was failed in rats that were supressed in the hypothalamic DNA methylation. But no report on DNA methylation's role and its mechanism involved in the onset of puberty is given. In the present study, expression changes of global DNA methylation, DNA methyltransferases and methyl CpG binding proteins in hypothalamus of the prepubertal and pubertal goat will be analyzed by multiple immunofluorescence labeling. In order to find candidate genes being regulated by DNA methylation state and playing important role in the onset of puberty, a whole genome DNA methylation profile and the mRNA expression profile of the hypothalamus will be mapped by using affinity chromatography enrichment hypermethylation components and deep sequencing and RNAseq technology, respectively. Key candidate genes controlled by DNA methylation will be found by bisulfite sequencing PCR. The function and mechanism of key candidate genes will be clarified at the molecular, cellular and animal level. The role and mechanism of DNA methylation in the onset of puberty will be predicted according to the integrated above-mentioned research results. The results will be conducive to elucidate the mechanism of the onset of puberty in a novel perspective and provide new clues for the regulation of the onset of puberty.

初情期的早与迟直接影响动物繁殖性能和生产效益，目前其机制尚不完全清楚。近来研究报道DNA甲基化与初情期启动有关，抑制大鼠下丘脑DNA甲基化导致初情期失败，但作用机制仍不清楚。本项目以山羊为研究对象，拟利用多重免疫荧光标记等技术分析山羊在初情期前后下丘脑的总体DNA甲基化水平、DNA甲基转移酶及甲基化CpG结合蛋白的表达变化规律；采用亲和柱层析法富集高度甲基化组分并对其进行深度测序，绘制下丘脑全基因组DNA甲基化谱式，运用RNAseq技术绘制mRNA表达谱式，以期发现在初情期启动中起重要作用且其表达受到DNA甲基化状态调控的一批候选基因；通过亚硫酸氢盐测序等方法继而发现表达受到DNA甲基化调控的关键候选基因；从分子、细胞和动物水平阐明关键候选基因的功能和机制。综合上述结果，解析DNA甲基化参与山羊初情期启动的作用和机制，研究结果将有助于从新角度阐明动物初情期启动机制并为其调控提供新线索。

初情期是动物从出生开始发育到获得繁殖能力的标志，其出现的早与迟直接关系到动物的性成熟和以后的繁殖性能。目前其机制尚不完全清楚。我国是养羊大国，后备母羊的饲养成本占据了养羊成本的一大部分，如果能缩短初情期年龄，将在很大程度上减少后备母羊的生产成本，并且一般来说初情期早的羊繁殖力较高。研究报道DNA 甲基化与初情期启动有关，抑制大鼠下丘脑 DNA 甲基化导致初情期失败，由此我们开展了山羊初情期启动中下丘脑DNA甲基化修饰改变的研究。.主要研究内容包括三个方面：第一，研究初情期前和初情期的黄淮山羊母羊的下丘脑是否存在总体 DNA甲基化及 DNMTs、MBPs 表达水平的变化。第二，绘制初情期山羊下丘脑DNA 甲基化谱及下丘脑组织中 mRNA 的表达谱式，筛选出在初情期方面起重要作用的其表达受到 DNA甲基化状态调控的候选基因。第三，对筛选的关键候选基因进行系统地分子、细胞和动物水平整体研究，确立受DNA甲基化状态调控的该基因的异常表达在初情期启动中的关键地位及其作用机制。.结果表明，在山羊初情期启动过程中，（1）下丘脑DNMTs与MBPs mRNA转录发生变化，其中DNMT1、MBD2和MECP2 mRNA上调，DNMT3A和MBD3 mRNA下调。（2）下丘脑全基因组甲基化水平保持不变。（3）下丘脑中DNA甲基化主要发生在CG位点。（4）不同的基因组功能区域甲基化水平存在差异，启动子区甲基化水平逐渐降低，最低的为5’UTR和外显子，最高为内含子。（5）筛选出了一批可能与初情期相关的基因如GRID1、PTPRN2等。（6）体外敲低侯选基因GRID1影响GnIH和GnRH mRNA的表达，敲低GABA-T影响KISS1 mRNA的表达。（7）体内敲低基因GRID1则初情期提前，敲低7天显著影响下丘脑GRID1 GnRH、RFRP-3和GluD1 mRNA的表达，在初情期启动时血清中GluD1浓度上升，P4减少，E2浓度没有变化。.研究表明DNA甲基化的改变调控山羊初情期的启动，这为探究初情期启动机制提供了新思路，为从生殖和遗传上调控山羊的初情期时间、提高繁殖性能提供科学的理论依据。